NK/T細(xì)胞淋巴瘤基因組中EBV DNA整合檢測及分析*

王欣 張旭東 陳清江 王冠男 胡俊霞 吳少璇 馬咪靜 尹美鳳 楊萬秋 董萌丁夢杰 張明智 朱利楠

NK/T細(xì)胞淋巴瘤（NK/T cell lymphoma，NKTCL）為一種高度侵襲性的非霍奇金淋巴瘤，其發(fā)病與EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染密切相關(guān)［1］。研究表明，約80%NKTCL患者血漿中可檢測到EBV DNA［2-3］。EBV為一種在全球范圍內(nèi)廣泛感染的皰疹病毒，主要有潛伏感染和裂解感染兩種形式，其中以潛伏感染最為多見［4］。潛伏狀態(tài)下，EBV在宿主細(xì)胞中僅編碼部分病毒產(chǎn)物，如EBV核抗原（EBV-determined nuclear antigen，EBNA）、EBV潛伏膜蛋白（latent membrane protein，LMP）、EBV編碼小RNA（EB-encoded small RNA，EBER）和終末蛋白（terminal protein，TP）。研究提示，上述蛋白及其相關(guān)通路是導(dǎo)致EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生的主要機制［5］。然而，也有部分研究表明，EBV DNA在宿主基因組中的整合也有可能是其致瘤原因之一［6-9］，其機制可能與病毒整合導(dǎo)致宿主基因組不穩(wěn)定，從而引起基因表達異常有關(guān)。目前，關(guān)于EBV致瘤性的研究多來自B細(xì)胞或鼻咽上皮細(xì)胞，在NK/T細(xì)胞中的研究較少，因此EBV相關(guān)NKTCL的發(fā)病機制尚未明確。本研究通過對5例EBV（+）NK/T樣本及4例EBV（-）NK/T樣本進行全基因組測序及生物信息學(xué)分析，初步探究EBV DNA在NKTCL中的整合情況，為進一步研究EBV在NKTCL發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 EBV（+）NKTCL細(xì)胞系SNK-6（樣本ID：EB_NK_pS）和 YTS（樣本 ID：EB_NK_pY）、EBV（+）鼻咽癌細(xì)胞系CNE1（樣本ID：EB_C_pC）、1例EBV（+）鼻腔NKTCL組織（EBV+Tissue-NKTCL）（樣本ID：EB_B_pR）、1例EBV（+）成人T/NK淋巴組織增殖性疾?。‥BV+T/NK-LPD）（2級）組織（樣本ID：EB_N_pZ）、EBV（-）NK細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系NK92（樣本 ID：EB_NK_n92）和 NKL（樣本 ID：EB_NK_nL）、EBV（-）T細(xì)胞白血病/淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat（樣本ID：EB_T_nJ）和健康人EBV（-）外周血正常NK細(xì)胞（樣本ID：EB_N_pF）共9例樣本，均由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物樣本庫提供。

1.1.2 試劑與儀器 DNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司提供，TaqDNA聚合酶、dNTP和PCR引物購自上海生工生物工程公司，DNA marker購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，EBER原位雜交檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PCR儀購自賽默飛世爾科技（中國）公司，凝膠成像儀購自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9052BS-m）購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，組織芯片機購自美國Beecher公司，TheraioBrite原位雜交儀購自美國StatSpin公司，石蠟切片機購自德國Leica公司，OLYMPUS BX51高級熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR法擴增EBV DNA和原位雜交法檢測EBER表達 提取9例樣本全基因組DNA，具體操作方法參考DNA提取試劑盒說明書進行。根據(jù)EBNA-3C特異性編碼序列區(qū)設(shè)計引物5′-AGAAGGGGAGCGTGTGTTGT-3′進行PCR擴增，擴增片段為153 bp。按常規(guī)操作規(guī)程將模板DNA、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP放入PCR儀中進行反應(yīng)，經(jīng)變性、退火、延伸共進行35個循環(huán)得到產(chǎn)物。對擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳后取出凝膠，置于凝膠成像系統(tǒng)，拍照并保存圖像。將常規(guī)石蠟包埋的EBV（+）鼻腔NKTCL組織（EBV+Tissue-NKTCL）和EBV（+）成人T/NK淋巴組織增殖性疾?。‥BV+T/NK-LPD）（2級）組織制成4 μm石蠟切片，經(jīng)56～60℃烤片2～16 h，具體操作方法參考EBER原位雜交試劑盒說明書進行。

1.2.2 全基因組測序及生物信息學(xué)分析 將9例樣本送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行DNA樣本檢測、文庫構(gòu)建、庫檢、Illumina Hiseq平臺測序、基本生物信息學(xué)分析（測序原始數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)質(zhì)量評估獲取Clean Data、參考序列比對分析、SNV/Indel/CNV/SV）和高級生物信息學(xué)分析（突變位點篩選、顯隱性模式篩選、基于家系研究、基因功能注釋、新生突變、基因功能富集分析、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析）。具體方法均為Illumina測序和生物信息學(xué)分析常規(guī)流程。

1.2.3 全基因組序列比對、捕獲并驗證EBV DNA整合序列 對9例樣本進行全基因組序列比對，使用BWA進行mapping，參考基因組為hg19。分析流程中，考慮到EBV的特性，將EBV的序列整合到參考基因組中進行序列比對。EBV整合信息捕獲示意圖（圖1）。對每個樣本構(gòu)建EBV的fasta文件，與構(gòu)建的EBV fasta庫進行Blast比對，從而確認(rèn)提取的序列是否是病毒序列。本研究從NCBI選取3個EBV genome序列來構(gòu)建fasta庫，3個EBV序列信息如下：1）Human herpesvirus 4 complete wild type genome（NC_007605）；2）Epstein-Barr virus（EBV）genome，strain B95-8（V01555）；3）HS4B958RAJ Epstein-Barr virus，artifactual joining of B95-8 complete genome and the sequences from Raji of the large deletion found in B95-8（M80517）。

圖1 EBV整合信息捕獲示意圖

1.2.4 過濾EBV DNA整合序列并對其進行染色體分布的統(tǒng)計 使用CREST軟件對bam文件進行softclip reads（一端比對到正常染色體，另一端比對到病毒序列的reads）提取，并抽取所有paired reads。對提取得到的paired reads進行過濾，步驟如下：1）去除部分未比對上的reads；2）去除部分比對到hs37d5的reads；3）去除 not primary alignment reads；4）去除未找到paired read的reads。對過濾后的reads進行染色體分布的統(tǒng)計。

1.2.5 對EBV DNA整合序列進行生物信息學(xué)分析及驗證 根據(jù)reads數(shù)在染色體上的分布情況，提取每個樣本bam文件中的EBV DNA高頻整合區(qū)域，使用IGV查看染色體部分區(qū)域比對情況，并設(shè)計PCR引物（p23.1F：5′-TTGGGGCTTTAAGTGGAAC-3′，P23.1R：5′-TCAGA GGGGAGCCAGGAC-3′）擴增EBV DNA在樣本基因組中的高頻整合區(qū)域，擴增片段進行sanger測序并與EBV基因序列進行比對。

2 結(jié)果

2.1 樣本EBV感染情況

經(jīng)PCR法及EBER原位雜交法檢測，5例EBV（+）樣本均可檢測出EBV DNA和EBER表達，4例EBV（-）樣本則未能檢出。PCR擴增結(jié)果（圖2），EBER原位雜交結(jié)果（圖3）。

圖2 樣本PCR擴增結(jié)果

2.2 全基因組生物信息學(xué)分析

經(jīng)北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行參考序列比對分析，9例樣本的測序深度、覆蓋深度、覆蓋率和比對率均滿足后續(xù)研究要求。測序深度（圖4），覆蓋深度和覆蓋率（圖5），比對率和覆蓋度統(tǒng)計見表1。（本研究關(guān)注的為EBV DNA的整合信息，因此常規(guī)的SNP、INDEL、SV、CNV檢測等全基因組的生物信息學(xué)分析在此未列出。）

圖4 樣本測序深度

圖5 樣本每個染色體的覆蓋深度和覆蓋率

2.3 EBV DNA整合序列的捕獲及驗證

經(jīng)個體化EBV整合分析流程捕獲softclip reads，比對樣本EBV fasta文件與構(gòu)建的EBV fasta庫，結(jié)果顯示提取的reads可以比對到構(gòu)建的EBV fasta庫，從而確認(rèn)提取的序列是病毒序列。

2.4 EBV DNA整合序列的染色體分布統(tǒng)計

對過濾后的reads進行染色體分布的統(tǒng)計。結(jié)果表明，相較EBV（-）樣本、EBV（+）鼻咽癌細(xì)胞系CNE1和EBV（+）T/NK淋巴組織增殖性疾病組織，EBV（+）NKTCL細(xì)胞系SNK、YTS和EBV（+）鼻腔NTKCL組織的EBV整合序列數(shù)目最多，2號染色體上的reads較其他染色體更多。統(tǒng)計結(jié)果見表2。

表1 比對率和覆蓋度統(tǒng)計

表2 EBV DNA整合序列的染色體分布統(tǒng)計

2.5 EBV DNA整合序列的生物信息學(xué)分析及驗證

根據(jù)reads數(shù)在染色體上的分布情況，提取每個樣本bam文件中chr2：33140000-33149000區(qū)域，使用IGV進行展示。樣本EB_B_pR、EB_NK_pS、EB_NK_pY bam文件2號染色體部分區(qū)域的IGV圖（圖6）。3個EB陽性樣本在chr2：30234084-30234483400bp區(qū)域均存在大量的插入與刪除。在IGV形象化展示中，每個顏色代表mapping質(zhì)量值高低，其中灰白色背景表示比對越高，顏色越深，比對質(zhì)量越低。每個顏色條代表1條read，每個read中會有1個cigar，將3個樣本放在一起比對，可以觀察到每個樣本的區(qū)域大致相同。對樣本EB_B_pR、EB_NK_pS、EB_NK_pY、EB_NK_n92、EB_NK_nL包含chr2：30234084-30234483 400 bp區(qū)域進行擴增，其中EBV（+）樣本擴增730 bp條帶，EBV（-）樣本擴增711 bp條帶，擴增片段進行sanger測序，發(fā)現(xiàn)EBV（+）NKTCL細(xì)胞系SNK、YTS和EBV（+）鼻腔NTKCL組織均存在chr2p23.1位點的插入缺失，且均為EBV基因組來源。sanger測序結(jié)果（圖7），PCR擴增結(jié)果（圖8）。

圖6 樣本EB_B_pR、EB_NK_pS、EB_NK_pY 2號染色體部分區(qū)域IGV圖

圖7 擴增片段部分區(qū)域sanger測序結(jié)果

圖8 樣本chr2：30234084-30234483 400 bp區(qū)域PCR擴增結(jié)果

3 討論

NKTCL為非霍奇金淋巴瘤的一種獨特亞型，84.8%NKTCL患者腫瘤組織中EBER陽性，亞洲人群中鼻型NKTCL的EBV陽性率幾乎達到100%，提示EBV在NKTCL的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［10］。Kim等［11］研究提示，血漿EBV DNA水平可為EBV感染提供直接證據(jù)，是監(jiān)測NK細(xì)胞淋巴瘤疾病進展和評估預(yù)后的重要指標(biāo)。Karaarslan等［12］研究表明，原位雜交法檢測EBER表達為目前判斷EBV感染的有效方法。本研究采用PCR法擴增EBV DNA和原位雜交法檢測EBER表達，5例EBV（+）樣本均可檢測出EBV DNA和EBER表達，4例EBV（-）樣本則未能檢出，與上述報道相一致。

EBV屬于人皰疹病毒γ亞科，是一種雙鏈DNA病毒，流行病學(xué)顯示多種惡性腫瘤與EBV感染有關(guān)，其中包括NKTCL［13］。目前，關(guān)于EBV致瘤性的研究多來自B細(xì)胞或鼻咽上皮細(xì)胞，雖然成熟NK/T細(xì)胞也是EBV正常的宿主細(xì)胞，但與B細(xì)胞或鼻咽上皮細(xì)胞相比，成熟NK/T細(xì)胞具有完全不同的生物學(xué)特點，與EBV相互作用機制也有根本性不同。因此，EBV相關(guān)NKTCL的發(fā)病機制尚未明確。多項研究表明，EBV編碼病毒產(chǎn)物，激活相關(guān)通路從而促進腫瘤發(fā)生［5，14-16］。目前，已有關(guān)于致瘤性病毒DNA整合位點的研究報道，這些整合位點遍布在宿主細(xì)胞每條染色體上，多數(shù)表現(xiàn)為隨機性，但有部分高頻的整合位點。如Adey等［17］研究表明，宮頸癌Hela細(xì)胞系染色體8q24存在HPV DNA高頻整合位點，此位點位于原癌基因MYC上游約500 kb。研究顯示，Hela基因組中HPV整合片段可以激活原癌基因MYC的表達［18-19］。本研究共選取5例EBV（+）和4例EBV（-）NK/T樣本進行全基因組測序和生物信息學(xué)分析，考慮到樣本含量較少，獲取的大量生物學(xué)信息多為復(fù)雜冗余信息。因此，本研究重點放在明確和驗證EBV DNA在基因組中的整合上。為此，本研究經(jīng)全基因組序列比對捕獲EBV整合序列，發(fā)現(xiàn)相較EBV（-）樣本、EBV（+）鼻咽癌細(xì)胞系CNE1和EBV（+）T/NK淋巴組織增殖性疾病組織，EBV（+）NKTCL細(xì)胞系SNK、YTS和EBV（+）鼻腔NTKCL組織的基因組中EBV整合序列最多，且3個樣本在chr2：30234084-30234483 400 bp區(qū)域均存在大量的插入與刪除，將3個樣本放在一起進行IGV比對，觀察到每個樣本的區(qū)域大致相同。本研究推測，在EBV陽性樣本chr2p23.1區(qū)域可能存在EBV DNA的整合位點，亟需進一步分析。因此，本研究對包含chr2：30234084-30234483 400 bp區(qū)域在內(nèi)的片段進行擴增并sanger測序，發(fā)現(xiàn)EBV（+）NKTCL細(xì)胞系SNK、YTS和EBV（+）鼻腔NTKCL組織中均存在chr2p23.1位點的插入缺失，且均為EBV基因組序列來源。

綜上所述，利用NCBI BLAST和USCS BLAT檢索chr2p23.1區(qū)域可發(fā)現(xiàn)，在chr2：29192774-29921611區(qū)域存在間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因序列，2007年Soda等［20-21］發(fā)現(xiàn)ALK基因重排，并表明棘皮動物微管相關(guān)類蛋白（echinoderm microtubule-associated protein-like 4，EML4）與ALK的融合（EML4-ALK）為非小細(xì)胞肺癌的驅(qū)動基因。此外，在chr2：30231531-30260033區(qū)域存在枝芽心臟基因（limb-bud and heart，LBH）。有研究發(fā)現(xiàn)，LBH的過度表達可能與肝細(xì)胞癌的不良預(yù)后有關(guān)［22］。本研究在chr2p23.1區(qū)域也檢索出XDH、YPEL5等基因序列和一些未知序列，提示EBV DNA在chr2p23.1區(qū)域的高頻整合可能影響相關(guān)基因表達，從而促進NKTCL的發(fā)生發(fā)展。但僅依據(jù)生物信息學(xué)分析不能明確EBV DNA整合對宿主基因組功能的影響，本研究將在后續(xù)研究中針對這一區(qū)域的關(guān)鍵基因開展生物信息學(xué)分析和生物學(xué)功能研究。