灌胃中鏈甘油三酯不同時(shí)程對(duì)小鼠抗疲勞作用的影響

錢 平，李曉莉，韓培濤，邵劍鋼，劉 晉

(1.軍需工程技術(shù)研究所，北京 100010； 2.陸軍勤務(wù)學(xué)院，重慶 401331； 3.93975部隊(duì)，烏魯木齊 830000)

高強(qiáng)度長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體肌肉力量的下降和最大輸出功率的降低，產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞，如果疲勞得不到恢復(fù)或消除，積累到一定程度時(shí)則導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降、內(nèi)分泌紊亂等病變。因此，抗疲勞研究是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的熱點(diǎn)。中鏈甘油三酯(MCT)是由含有8～12個(gè)碳原子的飽和脂肪酸與甘油通過酯化作用形成的甘油三酯，主要指辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯[1]。 MCT由于特殊的結(jié)構(gòu)，使得其具有消化吸收快、供能高等代謝特點(diǎn)和獨(dú)特的生理活性。研究表明，MCT在預(yù)防肥胖、改善糖和膽固醇代謝、抑菌、抗疲勞等方面具有一定的效果，是一種新型功能油脂[2-6]。

在MCT的抗疲勞作用研究方面，齊陽[7]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明，中、低劑量的MCT可調(diào)節(jié)糖脂代謝，節(jié)約糖原，增強(qiáng)脂肪的動(dòng)員，提高肝臟的抗氧化能力，具有抵抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用。馬雙雙[8]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中、低劑量的MCT能夠提高睡眠剝奪大鼠的抗氧化能力，防止氧化損傷，抵抗腦力疲勞。國外有研究認(rèn)為，MCT作為一種能源物質(zhì)，與碳水化合物之間的協(xié)同供給可以延長能量釋放，有效維持運(yùn)動(dòng)員在長時(shí)間運(yùn)動(dòng)過程中的能量需求[9]?，F(xiàn)有研究主要集中在MCT的抗疲勞作用和劑量確定方面，但關(guān)于服用MCT不同時(shí)程對(duì)抗疲勞作用的影響尚無詳細(xì)報(bào)道。本研究設(shè)計(jì)灌胃MCT不同時(shí)程小鼠的游泳疲勞模型，測定實(shí)驗(yàn)小鼠抗疲勞及抗氧化指標(biāo)，分析灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠抗疲勞作用的影響，并探討MCT抗疲勞作用的最短有效時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品與動(dòng)物

MCT粉劑：白色干燥松散粉末，奶油香味，無錫超科食品有限公司提供，生產(chǎn)日期為2016年4月1日，有效期至2018年3月31日，成品批號(hào)為43160401，檢驗(yàn)合格證號(hào)為D04001。

小鼠：健康雄性KM小鼠，等級(jí)SPF級(jí)，體重18～22 g，共120只，由湖北省實(shí)驗(yàn)研究中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(鄂)2015-0018，質(zhì)量合格證號(hào)為NO.42000600014395。飼養(yǎng)于湖北省食品藥品安全評(píng)價(jià)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樓(生物園區(qū))B-313(飼養(yǎng)室號(hào))，SPF(無特定病原體)級(jí)屏障環(huán)境，室溫20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，照度采用自動(dòng)定時(shí)開關(guān)控制，早上8點(diǎn)開啟，連續(xù)開啟10 h下午6點(diǎn)關(guān)閉。常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器及耗材

肝/肌糖原試劑盒、GSH測試盒、SOD試劑盒、乳酸測試盒、游離脂肪酸試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；濃硫酸和冰醋酸均為市售分析純。

貝克曼AU680全自動(dòng)生化分析儀，Multiskang O1510酶標(biāo)儀，高速離心機(jī)，DK-600S三用恒溫水箱，F(xiàn)M-20全自動(dòng)雪花制冰機(jī)，Direct-Q3超純水器，二氧化碳培養(yǎng)箱。

口罩，手套，濾紙，EP管，離心管，加樣槍頭，生理鹽水，純水等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理情況

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，將120只小鼠隨機(jī)分成6組，分別為CC、SC、SD、FD、TD組和TH組，每組20只，然后再將每組隨機(jī)分成2個(gè)小組，每個(gè)小組10只，用苦味酸打1～10號(hào)，并用電子天平稱初重。分組情況見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

注：①各組小鼠均按照20 mL/(kg·d)的灌胃容量進(jìn)行灌胃，MCT粉劑用純水配制，劑量為1 250 mg/(kg·d)；②前6 d每天的灌胃時(shí)間為上午9:00～10:00，第7天3 h組灌胃時(shí)間為上午7:00，其余各組灌胃時(shí)間為上午9:30，10:00進(jìn)行無負(fù)重游泳60 min實(shí)驗(yàn)和負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 游泳運(yùn)動(dòng)疲勞模型

1.2.2.1 無負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

在末次灌胃30 min后，取CC1、SC1、TH1、TD1、FD1組和SD1組小鼠進(jìn)行無負(fù)重游泳60 min實(shí)驗(yàn)，CC1組水深4 cm，其他各組水深35 cm，且各組均保持水溫為25℃±1℃。在游泳的過程中不斷攪拌水面使得小鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)，避免小鼠浮在水面上不游泳影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.2.2 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

在末次灌胃30 min后，取CC2、SC2、TH2、TD2、FD2組和SD2組小鼠尾部負(fù)重其自身體重5%的鉛皮進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。CC2組小鼠水深4 cm，其余各游泳組小鼠水深35 cm，水溫均為25℃±1℃，且在小鼠游泳的過程中不斷攪拌水面使得小鼠持續(xù)運(yùn)動(dòng)。小鼠自游泳開始至游泳死亡，即視為小鼠負(fù)重游泳力竭。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 體重測定

實(shí)驗(yàn)開始及末次灌胃前稱量所有組小鼠初重及末重，灌胃30 d期間每周灌胃前稱量小鼠體重，根據(jù)小鼠體重調(diào)整灌胃量。

1.2.3.2 負(fù)重游泳力竭時(shí)間測定

負(fù)重游泳組小鼠自游泳開始至死亡視為力竭，用秒表記錄小鼠自負(fù)重游泳開始到力竭所用時(shí)間即為小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間。

1.2.3.3 生化指標(biāo)測定

無負(fù)重游泳60 min后，肝糖原含量、血清乳酸(LD)含量、肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽(GSH)含量以及肝臟游離脂肪酸(FFA)含量通過試劑盒進(jìn)行測定；血糖(GLU)、血清尿素氮(BUN)送到檢測部利用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠體重的影響(見表2)

各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間皮毛光滑、活潑、精神狀況良好，體重穩(wěn)定增長，未出現(xiàn)有肉眼可見的異常。由表2可知，實(shí)驗(yàn)開始前，各組小鼠的初重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組小鼠體重都較實(shí)驗(yàn)前有了穩(wěn)定的增長，且各組小鼠的末重沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間體重的增加量也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)?？芍瑒┝繛? 250 mg/(kg·d)的MCT對(duì)小鼠的體重增加沒有顯著性影響。

表2 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠體重的影響 g

2.2 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響(見表3)

表3 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響

注：**表示與SC2組比較，p<0.01。

由表3可知，TH2、TD2、FD2組和SD2組小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間均極顯著延長(p<0.01)，且TH2組和SD2組較TD2組和FD2組更加明顯。

實(shí)驗(yàn)中對(duì)于MCT抗疲勞效果的評(píng)價(jià)采用的是運(yùn)動(dòng)耐力實(shí)驗(yàn)與生化指標(biāo)檢測相結(jié)合的方法。運(yùn)動(dòng)耐力的下降是疲勞最直接和客觀的表現(xiàn)，而力竭游泳時(shí)間是反映運(yùn)動(dòng)耐力的重要指標(biāo)[10]，因此可以通過力竭游泳時(shí)間反應(yīng)小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，進(jìn)而反應(yīng)其抗疲勞效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，急性灌胃MCT 3 h和短期灌胃MCT 3、5 d和7 d均能顯著延長小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間，且急性灌胃MCT 3 h和短期灌胃MCT 7 d延長小鼠力竭時(shí)間效果優(yōu)于短期灌胃MCT 3 d和5 d。這可能說明長時(shí)間的灌胃刺激降低了MCT提高運(yùn)動(dòng)耐力的功效，使得急性灌胃MCT 3 h延長負(fù)重游泳力竭時(shí)間的效果優(yōu)于短期灌胃MCT 3 d和5 d；而連續(xù)灌胃MCT 7 d可能使得MCT在機(jī)體內(nèi)部提高運(yùn)動(dòng)耐力的生物學(xué)效能得到一定的積累，從而使得小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間長于灌胃MCT 5 d和灌胃MCT 3 d。

2.3 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠血清BUN、LD、GLU的影響(見表4)

表4 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響 mmol/L

注：*表示與CC1組比較，p<0.05；**表示與CC1組比較，p<0.01；△表示與SC1組比較，p<0.05；△△表示與SC1組比較，p<0.01。下同。

在長時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)過程中，BUN的含量與運(yùn)動(dòng)負(fù)荷以及機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力有關(guān)，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷越大，機(jī)體的適應(yīng)能力越弱，BUN的含量就越大。

由表4可知，SC1組小鼠體內(nèi)血清BUN的含量顯著高于CC1組(p<0.05)。可能機(jī)理是：在無負(fù)重游泳60 min后，糖與脂肪供能不足時(shí)，肌肉中的蛋白質(zhì)或氨基酸在酶的催化作用下經(jīng)過轉(zhuǎn)氨基或者脫氨基后生成游離的氨基，游離的氨基與α-酮戊二酸經(jīng)過轉(zhuǎn)氨基作用形成丙酮酸和谷氨酸，谷氨酸可以透過線粒體膜進(jìn)入線粒體基質(zhì)中，然后在谷氨酸脫氫酶的催化作用下將氨基脫去形成游離的氨，再經(jīng)過尿素循環(huán)生成尿素，從而使得血中BUN含量增加；激烈運(yùn)動(dòng)后期核苷酸分解代謝增強(qiáng)產(chǎn)生的游離氨，經(jīng)尿素循環(huán)也會(huì)使得BUN含量增加。不同時(shí)程組與SC1組相比，血清BUN的含量均降低，TH1、TD1、FD1、SD1組分別比SC1組低17%、16%、7%和12%，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。結(jié)果表明，急性灌胃MCT和短期灌胃MCT在一定程度上表現(xiàn)出了降低耐力運(yùn)動(dòng)后小鼠體內(nèi)血清BUN含量的趨勢。

機(jī)體在正常的情況下，血糖的分解與合成處在一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡中，在機(jī)體進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，血糖的分解量大于血糖的合成量時(shí)，機(jī)體則會(huì)出現(xiàn)血糖含量降低，產(chǎn)生疲勞。本實(shí)驗(yàn)中，SC1組小鼠的血糖含量極顯著低于CC1組(p<0.01)，表明小鼠無負(fù)重游泳60 min，極大地消耗了體內(nèi)的血糖，產(chǎn)生了疲勞。TH1、TD1、FD1組及SD1組小鼠無負(fù)重游泳60 min后，其GLU含量均高于SC1組，其中TH1組小鼠血糖的均數(shù)比SC1組高71%，且TH1、FD1、SD1組的GLU含量顯著高于SC1組(p<0.01，p<0.05，p<0.01)。說明灌胃MCT不同時(shí)程在一定程度上均可以維持劇烈運(yùn)動(dòng)過程中血糖濃度的穩(wěn)定，且隨著灌胃MCT時(shí)程的延長，其穩(wěn)定血糖的生物學(xué)效能越好，起到抗疲勞的作用。

血乳酸是機(jī)體在長時(shí)間運(yùn)動(dòng)過程中糖酵解(糖的無氧氧化)的產(chǎn)物。乳酸在體內(nèi)的堆積可以干擾神經(jīng)沖動(dòng)和肌肉收縮進(jìn)而導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生，因此血乳酸的含量可作為抗疲勞效果評(píng)價(jià)的一個(gè)敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中TH1組與SC1組相比，其血乳酸含量幾乎沒有變化；TD1、FD1組及SD1組血清乳酸含量低于SC1組，且FD1、SD1組顯著低于SC1組(p<0.05)。表明短期灌胃MCT可以減少運(yùn)動(dòng)中血清乳酸的生成，且隨著灌胃MCT時(shí)程的延長，MCT降低血清乳酸含量的效果越明顯，而急性灌胃MCT一次無法降低血清乳酸含量。

2.4 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠肝臟組織SOD、GSH的影響(見表5)

表5 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠肝臟抗氧化能力的影響

SOD是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，在保護(hù)由氧自由基導(dǎo)致的細(xì)胞成分的直接氧化損傷中具有很重要的作用。

由表5可知，游泳對(duì)照組(SC1組)中肝臟SOD活性低于安靜對(duì)照組(CC1組)，表明劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)部抗氧化酶的活性降低。有實(shí)驗(yàn)證明劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)增加脂質(zhì)過氧化的程度，降低抗氧化酶的活性[11]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。急性灌胃3 h組(TH1組)及短期灌胃3、5、7 d組(TD1、FD1、SD1組)與SC1組相比，其SOD活性幾乎沒有變化，表明急性灌胃MCT及短期灌胃MCT對(duì)小鼠肝臟的SOD活性幾乎沒有影響。

GSH是體內(nèi)重要的保護(hù)因子，對(duì)保護(hù)細(xì)胞膜、線粒體膜等生物膜及蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子免受自由基的損傷起著重要的作用，GSH的含量可以作為評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中灌胃MCT不同時(shí)程組相比于SC1組，其肝臟GSH含量均有一定程度的增加，表明急性灌胃MCT和短期灌胃MCT均可以在一定程度上提升肝臟的抗氧化能力。

2.5 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠肝糖原和肝臟游離脂肪酸的影響(見表6)

表6 灌胃MCT不同時(shí)程對(duì)小鼠肝糖原和肝臟游離脂肪酸的影響

糖原是能量儲(chǔ)存的一種形式，主要儲(chǔ)存在肌肉和肝臟的細(xì)胞中，分別是肌糖原和肝糖原。在進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，維持肌肉收縮的能力高度依賴于對(duì)糖原的利用，當(dāng)肌糖原耗盡后，肝糖原開始分解以維持血糖濃度的穩(wěn)定，肝糖原含量是與疲勞相關(guān)的一個(gè)重要指標(biāo)。

由表6可知，SC1組小鼠肝糖原的含量極顯著低于CC1組(p<0.01)，提示無負(fù)重游泳60 min極大地消耗了小鼠體內(nèi)的肝糖原，導(dǎo)致疲勞的產(chǎn)生。急性灌胃組和短期灌胃組的小鼠的肝糖原含量較游泳對(duì)照組(SC1組)均上升，且短期灌胃MCT 3、5 d及7 d有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，說明不同灌胃時(shí)程組的MCT可以降低肝糖原的消耗，延緩疲勞的產(chǎn)生，且以短期灌胃組效果明顯。

在長時(shí)間有氧運(yùn)動(dòng)中，脂肪是主要的能源物質(zhì)。脂肪動(dòng)員是指脂肪在脂肪酶的作用下逐步水解為游離脂肪酸(FFA)及甘油，然后進(jìn)入血液中隨血液流經(jīng)全身為其他組織氧化供能的過程[12]。脂肪水解生成甘油和游離脂肪酸，由于肌細(xì)胞中缺乏甘油氧化代謝的酶，脂肪細(xì)胞內(nèi)也缺乏甘油激酶，因此甘油氧化代謝供能并不顯著[13]。脂肪供能主要是游離脂肪酸氧化供能，在氧氣充足的情況下，游離脂肪酸主要在肌肉和肝臟中可完全分解成水和二氧化碳，并以ATP的形式釋放出大量能量供機(jī)體利用；游離脂肪酸不完全氧化可生成酮體，酮體可以為心肌、大腦及骨骼肌等肝外組織提供能量，可以防止中樞性疲勞，節(jié)省血糖，維持機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力。本實(shí)驗(yàn)中，SC1組小鼠肝臟游離脂肪酸的含量顯著高于CC1組，表明運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體脂肪分解供能作用增強(qiáng)。這可能是由于運(yùn)動(dòng)時(shí)兒茶酚胺、生長激素、胰升血糖素、皮質(zhì)醇等促脂解激素的增加以及胰島素水平的降低[14]，導(dǎo)致脂肪水解增強(qiáng)。隨著灌胃MCT時(shí)程的延長，小鼠肝臟中游離脂肪酸的含量也逐漸增加，且SD1組小鼠肝臟中游離脂肪酸的含量顯著高于SC1組(p<0.05)。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)使用劑量的MCT對(duì)大鼠體重變化未產(chǎn)生顯著性影響；MCT急性灌胃3 h和短期灌胃3、5 d及7 d均可以提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，起到抗體力疲勞的作用，且綜合來看短期灌胃MCT 7 d 效果優(yōu)于其他灌胃時(shí)程組。