反膠束體系中脂肪酶催化合成單月桂酸甘油酯

張桂菊，王肖彥，王 瑞，陳芳莉，徐寶財

(北京工商大學 食品學院，北京市食品風味化學重點實驗室，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048)

單脂肪酸甘油酯具有良好的乳化、分散、抑菌等作用，被廣泛應用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領域[1-4]。與傳統(tǒng)的化學合成法相比，酶法合成單脂肪酸甘油酯具有反應條件溫和、耗能低、產(chǎn)品安全性高、無污染等優(yōu)點[5]。但是，在低溫條件下親脂性的反應底物(如油脂、三脂肪酸甘油酯等)與親水性的反應底物甘油的混溶性差，導致酶法合成單脂肪酸甘油酯的反應效率較低[6]。查寶萍等[7]在無溶劑體系中采用固定化脂肪酶催化椰子油制備單月桂酸甘油酯，在最佳反應條件下所得混合脂肪酸甘油酯中單月桂酸甘油酯含量僅為30%左右。因此，采用適宜的反應體系對于酶催化制備單脂肪酸甘油酯具有至關重要的作用。通過加入有機溶劑，可以增加底物溶解度、提高反應物的混溶性，從而加快反應速率并提高反應物的轉(zhuǎn)化率。但是，有機溶劑可能會使脂肪酶變性失活，影響其催化活性和穩(wěn)定性[8]。超臨界CO2、離子液體等也可作為酶催化制備單脂肪酸甘油酯的反應媒介，但是成本較高[9]。相對而言，反膠束體系易于制備、價格較為低廉，對親水和親油底物均具有良好的增溶性，有利于催化反應的進行，具有良好的應用前景。Itabaiana等[10]采用硬脂酸與丙酮縮甘油在AOT/異辛烷反膠束體系中進行脂肪酶催化酯化反應制備單硬脂酸甘油酯，反應僅30 min產(chǎn)率即可達80%。Park等[11]研究發(fā)現(xiàn)，羧酸酯酶在AOT/異辛烷反膠束體系中，催化活性最高，最優(yōu)條件下催化癸酸與甘油進行酯化反應制備1-單癸酸甘油酯產(chǎn)率可達80%以上。

本文研究了AOT/異辛烷反膠束體系的黏度及增溶水量等特性，同時考察了反應時間、AOT質(zhì)量濃度、含水量、脂肪酶濃度、緩沖液pH、底物摩爾比等因素對脂肪酶催化合成單月桂酸甘油酯的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三月桂酸甘油酯(純度>96%)，單月桂酸甘油酯、雙月桂酸甘油酯(純度>99%，Sigma-Aldrich公司)；AOT(純度≥97%)，異辛烷(分析純)，甘油(99.5%)，乙腈、丙酮(色譜純)，卡爾費休試劑(分析純)，奶酪香精脂肪酶(酶活力20 000 IU/g，丹麥諾維信生物技術有限公司)。

IS-RSV1立式恒溫振蕩器，Agilent1200高效液相色譜(安捷倫科技有限公司)，BSA423S電子天平，烏式毛細管黏度計，WS-6型微量水分測定儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 AOT/異辛烷反膠束溶液的配制

將適量AOT溶于異辛烷中，配成一定濃度的AOT/異辛烷溶液。稱取適量奶酪香精脂肪酶于磷酸鹽緩沖液中，用微量注射器將含酶緩沖液注入到AOT/異辛烷溶液中，振蕩混合至溶液澄清，即得含酶的AOT/異辛烷反膠束溶液。

1.2.2 反膠束溶液黏度的測定

移取10 mL純?nèi)軇┊愋镣橹翞跏橡ざ扔嬛校銣?0 min，測定純?nèi)軇┑牧鬟^時間。另移取10 mL反膠束溶液于烏氏黏度計中，測定反膠束溶液的流過時間。

根據(jù)Poiseuille方程，反膠束溶液和純?nèi)軇┑酿ざ圈呛挺?可以按方程式(1)和(2)進行計算：

η=kρt

(1)

η0=kρt0

(2)

式中：t、t0分別為反膠束溶液和純?nèi)軇┑牧鬟^時間，s；k為黏度計常數(shù)，0.014 17 mm2/s2；ρ為純?nèi)軇┑拿芏龋?.69 g/cm3。

相對黏度：ηr=η/η0

(3)

增比黏度：ηsp=(η-η0)/η0=ηr-1

(4)

1.2.3 Karl-Fischer法測定反膠束體系的增溶水量(W0)

在滴定瓶中加入一定量無水甲醇，用Karl-Fischer 試劑將甲醇中水分滴去，然后用微量進樣器準確向甲醇溶液加入10 μL蒸餾水，再用Karl-Fischer 試劑將溶液滴定至終點。從水分滴定儀上讀取所消耗溶液量，得出Karl-Fischer試劑相應系數(shù)。

用微量進樣器準確取反膠束溶液50 μL，迅速加入無水甲醇溶液中，用Karl-Fischer試劑將其滴定至終點，從水分滴定儀上準確讀取所消耗Karl-Fischer試劑體積，計算反膠束體系中增溶水的物質(zhì)的量。

反膠束溶液中W0計算：

W0=反膠束增溶水的物質(zhì)的量/反膠束體系中表面活性劑的物質(zhì)的量

(5)

1.2.4 反膠束“水池”直徑的計算

根據(jù)Kinugasa等[12]的研究，“水池”直徑dwp滿足以下公式：

dwp=0.25W0+1.14

(8)

1.2.5 反膠束體系中酶催化合成單月桂酸甘油酯

向反膠束體系中加入1 g三月桂酸甘油酯和一定量的甘油(甘油已采用4 ?型分子篩除水)置于立式恒溫振蕩器，在一定的條件下進行反應，定時取樣進行液相色譜分析。

1.2.6 定量分析單月桂酸甘油酯含量

采用高效液相色譜-示差折光檢測器(HPLC-RID)進行定量分析。分析條件：進樣量20 μL，流動相為乙腈-丙酮(1∶1)，流動相流速1 mL/min，柱溫35℃，檢測器溫度40℃。

定量分析方法采用外標法。分別配制不同質(zhì)量濃度的三月桂酸甘油酯、雙月桂酸甘油酯和單月桂酸甘油酯溶液，溶劑為乙腈-丙酮(體積比1∶1)，進行液相色譜分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標，液相色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。通過線性擬合得到：單月桂酸甘油酯標準曲線方程為y=-13 378.090 32+145 361.690 32x(R2=0.998 57)；雙月桂酸甘油酯標準曲線方程為y=10 643.812 1+142 003.302 9x(R2=0.997 88)；三月桂酸甘油酯標準曲線方程為y=47 708.012 9+139 361.428 2x(R2=0.998 57)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同含水量AOT反膠束體系的W0與黏度

在反膠束體系AOT質(zhì)量濃度0.06 g/mL、緩沖液pH 7.5、脂肪酶用量50 mg/mL時，改變反膠束體系的含水量，研究不同含水量對反膠束體系的W0、“水池”直徑及黏度等特性的影響，結(jié)果見表1。

表1 不同含水量的AOT反膠束體系的W0與黏度

由表1可以看出，隨著含水量的增大，反膠束體系的W0隨之增大，“水池”直徑隨著W0的增大而逐漸增大，“水池”溶解極性物質(zhì)的能力也隨之增大，反膠束基團聚集數(shù)增多。反膠束的W0是決定反膠束結(jié)構及物理性質(zhì)的重要物理參數(shù)，反膠束的“水池”直徑與其含水量成正比。因此，W0本身也反映了反膠束的大小[13]。當含水量達到0.09 mL/mL后，體系變渾濁，W0變化緩慢，說明加水達到一定程度后，“水池”中的水已經(jīng)達到飽和狀態(tài)，若加水量過大，將會增強水與界面的相互作用，破壞反膠束溶液結(jié)構，導致反膠束出現(xiàn)分相現(xiàn)象，不利于反應的進行。因此，含水量范圍確定為0.02～0.09 mL/mL。

AOT反膠束溶液黏度隨含水量增大先增加后降低。當含水量增大時，表面活性劑極性基頭與水分子的水化作用加強，會形成更多的聚集數(shù)，膠束之間的相互作用增強，黏度隨之增高[14]。反膠束不是剛性球體，當含水量達到0.09 mL/mL后，“水池”的形狀可能從球形或近球形到柱形之間變化，不同的形狀會導致膠束聚集數(shù)的變化，從而引起黏度改變[15]。

2.2 不同質(zhì)量濃度AOT反膠束體系的W0與黏度

在反膠束體系含水量0.05 mL/mL、緩沖液pH 7.5、脂肪酶用量50 mg/mL時，改變AOT的添加量，研究不同AOT質(zhì)量濃度對反膠束體系的W0、“水池”直徑及黏度等特性的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同AOT質(zhì)量濃度的反膠束體系的W0與黏度

由表2可以看出，隨著AOT質(zhì)量濃度的增加，W0、“水池”直徑及黏度也增加。這是因為表面活性劑的極性基頭與水分子強烈的水化作用，會形成較多的聚集束，膠束之間的相互作用增強，而黏度也會隨之增加。因此，表面活性劑的質(zhì)量濃度會影響反膠束體系的黏度以及“水池”的直徑。

2.3 反膠束體系單月桂酸甘油酯合成單因素實驗

2.3.1 反應時間的影響

在反應溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、底物摩爾比4∶1、含水量0.05 mL/mL、磷酸鹽緩沖液pH 7、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL、脂肪酶用量60 mg/mL時，考察反應時間對反應的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 反應時間對反應的影響

從圖1可以看出，隨著反應時間的延長，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)增加，在反應時間達到10 h后，三月桂酸甘油酯、單月桂酸甘油酯和雙月桂酸甘油酯質(zhì)量分數(shù)基本不變，反應達到平衡。綜合考慮，確定較優(yōu)的反應時間為10 h。

2.3.2 緩沖液pH對反應的影響

在反應溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應時間10 h、底物摩爾比4∶1、含水量0.05 mL/mL、脂肪酶用量60 mg/mL、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL時，考察緩沖液pH對反應的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 緩沖液pH對反應的影響

酶分子上有很多酸性、堿性氨基酸的側(cè)鏈基團，其隨著pH的變化處于不同的解離狀態(tài)，直接影響與底物的結(jié)合和進一步的反應，從而影響酶的活性[16]。即體系pH的改變將引起酶構象的改變，進而影響酶的催化能力。在陰離子表面活性劑AOT反膠束體系中，酶則依靠疏水作用到達油水界面，而且pH過高時帶負電荷的酶甚至會與陰離子表面活性劑產(chǎn)生較強的靜電排斥，導致酶在油水界面上的濃度迅速降低，從而對反應結(jié)果造成影響[17]。由圖2可知，隨著緩沖液pH的增加，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)升高，緩沖液pH為7.5時達到83.4%，緩沖液pH超過7.5后，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)降低。因此，采用pH為7.5的磷酸鹽緩沖液。

2.3.3 脂肪酶用量對反應的影響

在反應溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應時間10 h、底物摩爾比4∶1、含水量0.05 mL/mL、磷酸鹽緩沖液pH 7.5、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL時，考察脂肪酶用量對反應的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 脂肪酶用量對反應的影響

從圖3可以看出，隨著脂肪酶用量的增加，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)不斷增加，在50 mg/mL時達到最大，為83.4%，當脂肪酶用量超過50 mg/mL之后，對單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)影響較小。這可能是由于在催化劑用量較少時，底物相對于酶較為充足，酶被充分利用，故單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)隨著脂肪酶用量的增加而增加；當脂肪酶用量增加到一定程度時，酶相對于底物而言已經(jīng)過剩，對反應的影響較小[18]。因此，選擇脂肪酶用量為50 mg/mL。

2.3.4 底物摩爾比對反應的影響

在反應溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應時間10 h、含水量0.05 mg/mL、磷酸鹽緩沖液pH 7.5、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL、脂肪酶用量50 mg/mL時，考察底物摩爾比對反應的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 底物摩爾比對反應的影響

由圖4可知，當甘油與三月桂酸甘油酯的摩爾比為1∶1時，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)為53.6%，增加體系中甘油的量，有利于反應的進行。當?shù)孜锬柋葹?∶1時，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)為82.5%。底物摩爾比增加至4∶1時，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)達到83.3%，再繼續(xù)增大甘油的量，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)不斷降低。原因可能是在一定范圍內(nèi)，增加反應物甘油的量有利于反應向正反應方向進行，超過一定量時，過量的甘油包覆在脂肪酶表面導致其失活[19]。從經(jīng)濟性的角度考慮，較優(yōu)底物摩爾比為3∶1。

2.3.5 含水量對反應的影響

在反應溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應時間10 h、底物摩爾比3∶1、磷酸鹽緩沖液pH 7.5、AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL、脂肪酶用量50 mg/mL時，考察含水量對反應的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 含水量對反應的影響

由圖5可知，反應體系含水量低，反膠束“水池”中的絕大部分水與表面活性劑結(jié)合，用于反膠束的構成而保持反膠束中酶活性構象所需的自由水減少，影響酶活力的提高[20]，且形成的反膠束的尺寸不能完全包含酶分子，導致酶的活力不高，隨著含水量的增大，維持酶構象的自由水增多，酶的活性增大，在含水量為0.05 mL/mL時達到最佳，當含水量大于0.05 mL/mL時，隨著含水量的增大，不僅使油水界面減小，而且可能導致酶的結(jié)構過于松弛，柔性過大，影響酶活力的發(fā)揮。另外，含水量過大將使反應向反方向移動，不利于單脂肪酸甘油酯的生成。因此，最佳含水量為0.05 mL/mL。

2.3.6 AOT質(zhì)量濃度對反應的影響

在反應溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min、反應時間10 h、底物摩爾比3∶1、含水量0.05 mL/mL、磷酸鹽緩沖液pH 7.5、脂肪酶用量50 mg/mL時，考察AOT質(zhì)量濃度對反應的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 AOT質(zhì)量濃度對反應的影響

表面活性劑(AOT)質(zhì)量濃度關系到反膠束的形成和酶的催化活性，AOT質(zhì)量濃度太低，無法形成反膠束溶液，而AOT質(zhì)量濃度太高，對脂肪酶有毒害作用，抑制酶的活性[21]。由圖6可知，隨著AOT質(zhì)量濃度的增加，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)不斷增加，當AOT質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時，單月桂酸甘油酯質(zhì)量分數(shù)最高，為84.2%。繼續(xù)增加AOT質(zhì)量濃度，由于對脂肪酶催化活性的抑制作用，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)開始下降。因此，最佳AOT質(zhì)量濃度為0.1 g/mL。

在上述優(yōu)化的工藝條件(反應時間10 h，緩沖液pH 7.5，脂肪酶用量50 mg/mL，底物摩爾比3∶1，含水量0.05 mL/mL，AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL)以及反應溫度55℃、振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min下，重復3次驗證實驗，反應體系單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)為84.4%。

2.4 反膠束體系特性與酶催化反應結(jié)果的相關性

反膠束酶催化反應體系是一個熱力學動態(tài)平衡的體系，酶分子在反膠束中所處的位置取決于酶自身的親水/疏水特性。脂肪酶具有油/水界面親和力，一般位于油水界面的內(nèi)表面或者疏水尾鏈區(qū)域[22]，如圖7所示。

圖7 反膠束脂肪酶催化反應示意圖

對于脂肪酶催化三月桂酸甘油酯與甘油進行甘油解反應而言，親水性的底物甘油可溶于反膠束體系的納米水核，而親脂性的底物三月桂酸甘油酯溶于有機溶劑或附著于油水界面的表面活性劑膜上，底物與酶分子在油/水界面接觸并發(fā)生催化反應。由于反膠束均為納米尺度，具有非常大的界面積，從而加快酶催化反應的速度。

增溶水量(W0)是表征反膠束微聚集體大小的基本特性參數(shù)之一，而體系黏度對于酶催化反應的傳質(zhì)作用具有非常重要的影響，因此結(jié)合2.1、2.2以及2.3.5、2.3.6部分的實驗數(shù)據(jù)，分析了反膠束體系增溶水量和相對黏度與酶催化反應體系中單月桂酸甘油酯質(zhì)量分數(shù)的相關性。

當含水量為0.02～0.07 mL/mL時，W0隨著含水量的增加而線性增加，之后W0增速減緩，當含水量增加至0.08 mL/mL后W0變化不大。當含水量為0.02～0.05 mL/mL時，體系相對黏度隨著含水量的增加而顯著增加，當含水量增加至0.05 mL/mL后體系相對黏度變化較小。當AOT質(zhì)量濃度為0.02～0.10 g/mL時，W0隨著AOT質(zhì)量濃度增加而線性增加，之后增速減緩。反膠束體系的黏度隨著AOT質(zhì)量濃度(0.02～0.16 g/mL)增加而線性增加。由圖5、圖6可知，酶催化反應體系中單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)隨著含水量、AOT質(zhì)量濃度的增加先增大后減小，當含水量為0.05 mL/mL、AOT質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時，單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)最大。

綜合上述結(jié)果可知，當AOT質(zhì)量濃度和含水量較小時，隨著AOT質(zhì)量濃度、含水量的增加，W0增加，反膠束體系增溶底物的量增加，且體系黏度較小，因此促進了酶催化反應的進行。但是當AOT質(zhì)量濃度和含水量增加到一定程度之后，W0繼續(xù)增加，雖然增溶底物的量增加，但是反膠束的尺寸也隨之增加，從而油/水界面積減小，同時體系黏度的增加影響了底物與脂肪酶之間的傳質(zhì)作用，因此不利于酶催化反應的進行。另外，如前所述，反膠束體系中的水及AOT對酶的結(jié)構和活性都有一定的影響，反膠束體系對于酶催化反應的影響機制非常復雜，還有待深入研究。

3 結(jié) 論

AOT/異辛烷反膠束體系中，采用三月桂酸甘油酯與甘油進行脂肪酶催化甘油解反應制備單月桂酸甘油酯，通過單因素實驗對合成工藝進行優(yōu)化，得到最佳工藝條件為：反應溫度55℃，振蕩器轉(zhuǎn)速180 r/min，AOT質(zhì)量濃度0.1 g/mL，含水量0.05 mL/mL，脂肪酶用量50 mg/mL，緩沖液pH 7.5，底物摩爾比(甘油與三月桂酸甘油酯摩爾比)3∶1，反應時間10 h。在最佳條件下，反應體系中單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分數(shù)為84.4%。通過對AOT反膠束體系的一些基本特性的研究，對脂肪酶催化甘油解制備單脂肪酸甘油酯反應條件的選擇提供參考。同時對于反膠束體系增溶水量及體系黏度與酶催化反應結(jié)果的相關性進行了分析，但是對于反膠束體系的基本特性對酶催化反應的影響機制還有待深入研究。