膠原結(jié)合域改良胰島素樣生長(zhǎng)因子(CBD-IGF-1)對(duì)預(yù)防大鼠早期坐骨神經(jīng)擠壓損傷后肌肉萎縮的研究

于英奇，李建安，夏 鵬，潘 肅，包天翼，余雙奇，王 靜，孟 洋，尹 飛，楊小玉*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科，吉林 長(zhǎng)春130041；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 骨科，吉林 長(zhǎng)春130033)

研究背景：在當(dāng)今骨科領(lǐng)域，神經(jīng)損傷后的肌肉萎縮一直制約著患者的療效。神經(jīng)損傷后，骨骼肌因?yàn)槭チ松窠?jīng)的營(yíng)養(yǎng)作用而出現(xiàn)萎縮，而且出現(xiàn)一些列的形態(tài)結(jié)構(gòu)，生理生化及代謝功能改變。目前針對(duì)神經(jīng)損傷后肌肉萎縮有電極刺激等方法[1]，但多數(shù)都是作為一種輔助的療法。IGF-1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，不但能保護(hù)神經(jīng)元并為神經(jīng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，而且能促進(jìn)雪旺細(xì)胞增值，從而起到促進(jìn)神經(jīng)再生的作用[2]，因此IGF-1對(duì)中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)均有修復(fù)作用，而且可以預(yù)防神經(jīng)損傷后的肌肉萎縮。而對(duì)CBD-IGF-1的前期研究表明重組的蛋白膠原結(jié)合活性明顯增加，相較于IGF-1，CBD-IGF-1對(duì)神經(jīng)的有效作用時(shí)間更長(zhǎng)，而且可以更有效地促進(jìn)神經(jīng)再生[3]。防止本實(shí)驗(yàn)通過制造大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，將CBD-IGF-1浸潤(rùn)于坐骨神經(jīng)，四周后測(cè)量大鼠肌肉的濕重及肌肉纖維的橫截面積及直徑，探究CBD-IGF-1對(duì)預(yù)防大鼠神經(jīng)損傷后肌肉萎縮的作用，為IGF-1應(yīng)用于臨床預(yù)防神經(jīng)損傷后肌肉萎縮提供參考。

1 材料與方法

膠原結(jié)合域改良胰島素生長(zhǎng)因子-1(前期由本課題組在實(shí)驗(yàn)室中合成)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取健康成年SD雌性大鼠24只(由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，質(zhì)量為210 g-240 g之間。

1.1 動(dòng)物分組及手術(shù)方法

采用隨機(jī)抽樣法將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為四組，分別為：正常組，IGF-1對(duì)照組，CBD-IGF-1實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組。編號(hào)1-24。將4組大鼠分別用水合氯醛(400 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉后，股部剪毛 ，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。術(shù)前行常規(guī)碘伏消毒,四組大鼠在無菌條件下顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)；分別對(duì)IGF-1對(duì)照組，CBD-IGF-1實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組大鼠右側(cè)的距離神經(jīng)梨狀肌下緣6 mm處坐骨神經(jīng)處以持針器鉗夾坐骨神經(jīng)3次,每次5 s,擠壓寬度為3 mm，擠壓后的坐骨神經(jīng)呈透明狀，分別用CBD-IGF-1對(duì)1-6號(hào)；IGF-1對(duì)7-12 號(hào)大鼠的坐骨神經(jīng)損傷的部位做浸潤(rùn)處理，13-18號(hào)為正常組，只做顯露，對(duì)坐骨神經(jīng)不做任何處理然，19-24號(hào)為對(duì)照組，只夾閉神經(jīng)，不做浸潤(rùn)處理。對(duì)24 只大鼠逐層縫合傷口，術(shù)后對(duì)大鼠腹腔內(nèi)注射青霉素10萬U預(yù)防感染，每日1次，時(shí)間為3 d。

1.2 取材與組織切片

術(shù)后四周用脊髓脫臼法處死各組大鼠，術(shù)后顯露并從股骨內(nèi)外髁起點(diǎn)至股骨結(jié)節(jié)止點(diǎn)完整切取右側(cè)小腿腓腸肌,并同時(shí)用同樣方法取出對(duì)側(cè)腓腸肌，用日本島津公司生產(chǎn)電子天平libpor ael-40 sm(精確度1∶10 000)測(cè)量雙側(cè)小腿腓腸肌肌濕重,左側(cè)和右側(cè)腓腸肌做重量對(duì)比后.稱重結(jié)束后將右側(cè)腓腸肌放入4%的甲醛溶液予以固定。常規(guī)石蠟包埋,厚度為4 μm,行H.E染色系統(tǒng)測(cè)出隨機(jī)5個(gè)視野中每個(gè)視野的腓腸肌肌纖維橫截面積、肌肉纖維直徑，同時(shí)光鏡下觀察肌纖維大體形態(tài) ，使用image pro plus 6.0 軟件進(jìn)行分析測(cè)量纖維橫截面積、肌肉纖維直徑。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腓腸肌大體形態(tài)觀察及濕重變化

24只大鼠左側(cè)腓腸肌及正常組雙側(cè)腓腸肌均飽滿有彈性，色澤佳；IGF-1對(duì)照組，CBD-IGF-1實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組右側(cè)腓腸肌明顯萎縮變薄、色澤蒼白。IGF-1對(duì)照組，CBD-IGF-1實(shí)驗(yàn)組大鼠的右側(cè)腓腸肌萎縮不明顯，色澤較佳，四組肌濕重相比差異有非常顯著性意義(P<0.01)，結(jié)果如表1所示。

表1 大鼠的肌肉濕重比較

2.2 腓腸肌的鏡下觀察

正常肌肉纖維細(xì)胞在一個(gè)束狀的多邊形結(jié)構(gòu)中，外圍有若干細(xì)胞核，與正常組相比在CBD-IGF-1，IGF-1，及空白對(duì)照組中，肌肉纖維的束狀結(jié)構(gòu)均有不同程度的紊亂和改變，這顯示了肌肉有不同程度的萎縮，甚至有些已經(jīng)失去了多邊形的結(jié)構(gòu)，肌肉外纖維中細(xì)胞核也有不同程度正度的聚集與增生，在對(duì)正常組的大鼠的鏡下微觀形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肌肉纖維均以多邊形和多核的形式呈束狀排列，其核位于肌質(zhì)膜的周圍。在對(duì)IGF-1組，CBD-IGF-1組，對(duì)照組的鏡下觀察發(fā)現(xiàn)某些肌肉纖維由于神經(jīng)損傷而出現(xiàn)典型的改變，除了一些纖維喪失特有的多邊形形狀外，肌肉纖維的束狀結(jié)構(gòu)有明顯的紊亂和大小的改變，這表明肌肉有不同程度的萎縮，通過觀察發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組中肌肉纖維具有更明顯的形態(tài)學(xué)損傷特征，衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞核聚集在一側(cè)，肌肉外纖維增加。鏡下呈幾乎沒有呈束狀排列的肌肉纖維，肌肉纖維的排列大多呈圓形或橢圓形。但對(duì)IGF-1組，CBD-IGF-1組觀察發(fā)現(xiàn)肌肉萎縮較之空白組并不明顯，衛(wèi)星細(xì)胞相較于正常組略增加，肌肉纖維呈多邊形束狀排列的數(shù)量相較于對(duì)照組增加，有肌肉損傷特征的肌肉纖維較之空白組減少，但肌肉外纖維組織增生不明顯，有一部分受傷的肌肉纖維其中一些在退化，另一些已經(jīng)在再生，肌肉之間可見有毛細(xì)血管，這可能是新生成的毛細(xì)血管。這些血管可能參與肌肉的再生。而CBD-IGF-1相比于IGF-1可以看到更多的毛細(xì)血管再生，有更多的肌肉細(xì)胞接近于正常形態(tài)。

2.3 肌肉的橫截面積及直徑測(cè)量

組織切片后對(duì)大鼠的腓腸肌肌肉橫截面積及肌肉直徑進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果如表2所示，結(jié)果顯示相比較于正常組，IGF-1對(duì)照組，CBD-IGF-1實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的肌肉橫截面積及肌肉直徑均有不同程度的縮小，但I(xiàn)GF-1對(duì)照組，CBD-IGF-1實(shí)驗(yàn)組大于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，同時(shí)CBD-IGF-1實(shí)驗(yàn)組大于IGF-1對(duì)照組，其差異有非常顯著的意義(P<0.01)。

表2 大鼠的肌肉橫截面積及肌肉直徑

3 討論

作為周圍神經(jīng)的靶器官，骨骼肌在神經(jīng)損傷后由于失去了神經(jīng)的營(yíng)養(yǎng)作用而出現(xiàn)一系列微觀改變包括肌肉纖維變細(xì)，肌肉纖維排列紊亂，肌肉纖維溶解，線粒體腫脹變性等 ，而從宏觀角度，這些改變導(dǎo)致了肌肉萎縮的發(fā)生，這種改變往往是不可逆的，因此臨床上常常有由于神經(jīng)損傷而導(dǎo)致肢體功能喪失的病例[4]。

本研究的所使用的坐骨神經(jīng)損傷模型可以理解為軸突損傷模型[5,6]，這會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)肌肉之間的連接中斷，這種損傷能導(dǎo)致肌肉形態(tài)的變化，如肌肉的橫截面積減小，肌纖維的直徑變?。患∪獾闹亓繙p少；本實(shí)驗(yàn)在空白對(duì)照組中通過觀察證實(shí)了神經(jīng)損傷后神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)中斷從而產(chǎn)生了相應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化 polonio也觀察到在受傷的坐骨神經(jīng)支配的肌肉中出現(xiàn)輪廓不規(guī)則，細(xì)胞核聚集等變化這些變化可能導(dǎo)致不同程度的功能喪失[7]。骨骼肌是神經(jīng)的靶器官，并且利用神經(jīng)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換，神經(jīng)損傷4周后，受損的肌肉纖維仍處在一個(gè)在不斷再生的過程中，其中有某些炎性介質(zhì)參與其中[8]。通過觀察應(yīng)用IGF-1-1和CBD-IGF-1的后可以導(dǎo)致炎性反應(yīng)的增強(qiáng)，血管增生加強(qiáng)，相較于損傷組有更加復(fù)雜的組織學(xué)形態(tài)。

IGF-1是一種多肽生長(zhǎng)因子，它含有70個(gè)氨基酸，分子量約為7.5 kDa，與胰島素原有相似結(jié)構(gòu)性[9-11]。IGF-1在組織生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要作用，而最近研究表明IGF-1在促進(jìn)周圍神經(jīng)修復(fù)中也有一定潛在的作用，IGF-1對(duì)損傷神經(jīng)的修復(fù)作用主要表現(xiàn)在：①IGF-1科一促進(jìn)雪旺細(xì)胞增值和分化。②能夠調(diào)節(jié)軸突及突觸的形成，促進(jìn)樹突的生長(zhǎng)。③，在神經(jīng)損傷后的應(yīng)激狀態(tài)下IGF-1可以抑制蛋白質(zhì)分解，避免神經(jīng)受到過度損傷[12]。但有研究表明是其原生形態(tài)作用較為局限，IGF-1的在體內(nèi)的半衰期為8 h-16 h.因此IGF-1半衰期短、迅速擴(kuò)散一直制約著IGF-1的廣泛應(yīng)用。而且一旦高劑量應(yīng)用可能會(huì)引起相關(guān)并發(fā)癥。之前的研究顯示提內(nèi)的許多組織，如主動(dòng)脈、皮膚等含有膠原結(jié)合域，因此可以成為膠原結(jié)合域結(jié)和的靶點(diǎn)，本課題組前期研究合成的CBD-IGF-1蛋白分子量在5 kDa-10 kDa之間，而人體免疫系統(tǒng)清除作為內(nèi)毒素或抗原的蛋白質(zhì)往往分子量大于10 kDa[13,14]，所以CBD-IGF-1的分子量可以避免被人體免疫系統(tǒng)所清除。而且前期研究在分子生物學(xué)角度通過ELISA證明了CBD-IGF-1可以有效地與I型膠原結(jié)合并且可以有效地體高細(xì)胞增殖率，同時(shí)CBD-IGF-1可以誘導(dǎo)施萬細(xì)胞內(nèi)的IGF-1-1R mRNA持續(xù)且相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)，且對(duì)NGF mRNA的表達(dá)有顯著促進(jìn)作用。

之前有研究表明，神經(jīng)元的存在能夠有效維持骨骼肌的肌力，且能夠有效的預(yù)防肌肉萎縮[15,16]。所以修復(fù)受損的神經(jīng)是預(yù)防肌肉萎縮的關(guān)鍵，而IGF-1近年來已被證明能夠有效地促進(jìn)損傷后的神經(jīng)修復(fù)，但是有其相對(duì)局限性。本實(shí)驗(yàn)通過模擬大鼠坐骨神經(jīng)模型，將CBD-IGF-1和IGF-1分別應(yīng)用于大鼠損傷后的坐骨神經(jīng)，測(cè)量肌肉的橫截面積，肌肉纖維的直徑，肌肉的濕重?cái)?shù)值，對(duì)改良后的IGF-1的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示在對(duì)大鼠的坐骨神經(jīng)損傷后出現(xiàn)的肌肉萎縮，CBD-IGF-1相較于IGF-1有更好的預(yù)防作用。