黃瓜響應(yīng)低溫脅迫的生理及分子機制研究進展

李彩霞 董邵云 薄凱亮 苗 晗 張圣平 顧興芳

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜（Cucumis sativusL.）起源于喜馬拉雅山南麓的熱帶雨林地區(qū)，喜溫暖但不耐寒冷，屬典型的冷敏感型植物（安志信 等，2006）。黃瓜是重要的經(jīng)濟作物之一，我國是世界上黃瓜栽培面積最大的國家，且在北方地區(qū)反季節(jié)栽培面積不斷增加。黃瓜的適宜生長溫度范圍為：白天25～30℃，夜間13～15 ℃（李會敏，2016）。但我國北方地區(qū)冬春季黃瓜栽培中普遍存在長期偏低溫（＜20 ℃/8～12 ℃，晝/夜）和短期臨界低溫（15℃/4～8 ℃，晝/夜）的問題（王永健 等，2005）。黃瓜各器官組織均對低溫敏感（Cabrera et al.，1992），低溫脅迫對黃瓜不同發(fā)育階段都會產(chǎn)生不同程度的危害，如種子發(fā)芽率降低，苗期葉片邊緣黃化、枯死和內(nèi)卷，開花期受精率下降，結(jié)果期坐果率下降，化瓜、畸形瓜嚴重，貯藏和運輸期果實易發(fā)生腐爛，品質(zhì)下降（郝敬虹 等，2009；王紅飛 等，2016），低溫脅迫已成為制約黃瓜豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要逆境因素。因此，通過研究低溫脅迫對黃瓜生理生化方面的影響，挖掘黃瓜的耐寒基因，探索提高黃瓜低溫耐受性的有效措施，將為解決黃瓜低溫冷害問題、培育耐低溫黃瓜新品種提供重要的參考依據(jù)。

1 黃瓜響應(yīng)低溫脅迫的生理生化基礎(chǔ)

低溫脅迫下，黃瓜能通過影響膜系統(tǒng)組分的變化、激活活性氧清除系統(tǒng)、調(diào)節(jié)激素含量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及影響光合特性等生理生化機制來適應(yīng)低溫環(huán)境（Ruelland et al.，2009；李猛 等，2018）。

1.1 膜系統(tǒng)組分

細胞膜是進行生命活動的重要場所，作為滲透屏障參與物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)合成和跨膜信號的識別與傳遞等。冷害的根本原因是細胞膜系統(tǒng)受損，“膜脂相變”學(xué)說表明，細胞膜首先感應(yīng)低溫信號并作出一系列的生理反應(yīng)，如膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，產(chǎn)生丙二醛，從而影響其他正常代謝的進行（李曉靖和崔海軍，2018）。

1.1.1 膜結(jié)構(gòu)的改變 低溫脅迫會導(dǎo)致生物膜發(fā)生相變和結(jié)構(gòu)上的變化。膜由液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，膜脂中不飽和脂肪酸的含量下降，膜流動性下降，從而導(dǎo)致細胞質(zhì)液泡化，離子大量外滲，通透性增加，膜結(jié)合酶活性降低，呼吸受阻，能量供應(yīng)不足，細胞代謝變化和細胞功能紊亂 等，植物耐寒性降低（Lyons et al.，1979）。Shi等（2008）研究發(fā)現(xiàn)黃瓜的亞麻酸（C18：3）、棕櫚酸（C16：0）、油酸（C18：1）、亞油酸（C18：2）和硬脂酸（C18：0）與黃瓜的耐低溫性密切相關(guān)。低溫處理的黃瓜子葉中，雙半乳糖甘油二酯（DGDG）含量明顯升高，而磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）含量顯著降低，DGDG和PC不飽和度增多，從而C18：3顯著增多（楊玲，2001）。

1.1.2 膜代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生 低溫脅迫條件下膜脂過氧化的終產(chǎn)物丙二醛（MDA）是衡量黃瓜耐低溫性的一個重要指標（周雙 等，2015）。MDA可與蛋白質(zhì)或核酸大分子之間發(fā)生交聯(lián)、聚合，導(dǎo)致酶失活，對細胞起毒害作用（Rihan et al.，2017）。MDA含量與低溫脅迫程度呈負相關(guān)，不同低溫處理黃瓜幼苗，處理溫度越低，膜脂過氧化程度越重，MDA含量越高，抗寒性越差；黃瓜幼苗的耐冷性越強，MDA含量越低（田明剛，2005；方媛 等，2016）。

1.2 保護酶系統(tǒng)

活性氧具有很強的氧化能力，活性氧的大量積累導(dǎo)致細胞傷害。正常情況下，細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)。低溫脅迫下，植物體內(nèi)保護酶如超氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、過氧化物酶（POD）、愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（GPX）的活性提高，通過保護酶活性的提高來減少活性氧的積累，從而減輕對植物的傷害（Lee & Lee，2000）。黃瓜幼苗在低溫脅迫恢復(fù)過程中，其保護酶（SOD、POD、CAT、APX）的活性先升高后降低，且不同基因型差異較大（吳燕 等，2018）。于錫宏等（2011）采用不同的低溫脅迫方式處理黃瓜幼苗，漸降低溫脅迫（以每小時下降 1 ℃的平均速度進行降溫處理）與直降低溫脅迫相比，其保護酶（SOD、POD、CAT）活性顯著增強，冷害指數(shù)降低，黃瓜幼苗受冷害的程度減緩。

1.3 激素含量

激素與植物耐寒性有著密不可分的關(guān)系。張穎等（2012）研究發(fā)現(xiàn)：外源噴施脫落酸（ABA）可以緩解低溫下黃瓜幼苗中POD、SOD活性的增加和CAT活性的降低；外源ABA施用量與植物的耐寒性呈正相關(guān)。董春娟等（2017）發(fā)現(xiàn)水楊酸（SA）既可增強黃瓜幼苗葉片光合作用和活性氧的清除，又可誘導(dǎo)黃瓜幼苗根系FAD基因表達，提高黃瓜幼苗抗寒性。葉面噴施Ca2+可以通過影響ABA和SA的含量，從而影響黃瓜幼苗的耐冷性（楊楠 等，2012）。王麗麗和于錫宏（2004）的研究表明，低溫脅迫程度與黃瓜體內(nèi)赤霉素（GA）和生長素（IAA）的含量呈正相關(guān)；隨著低溫時間的延長，GA和IAA含量先升高后降低。內(nèi)源PAs（多胺）可以通過阻止線粒體中NADPH氧化酶的低溫誘導(dǎo)活性來增加黃瓜對低溫的耐受性（Shen et al.，2000）。外源施用PAs后，低溫脅迫下黃瓜幼苗中的GPX活性上升，SOD和CAT的活性略有下降，從而影響了黃瓜對低溫的應(yīng)激能力（Kubi?，2008）。

1.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能夠維持細胞膨壓和氣孔開放，保證生理生化過程和光合作用正常進行。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要包括無機物質(zhì)（K+、Ca2+等）和有機物質(zhì)（脯氨酸、可溶性糖等）。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與低溫脅迫具有明顯相關(guān)性。劉潔等（2015）研究表明黃瓜的耐低溫性與葉片中K的質(zhì)量分數(shù)呈正相關(guān)。脯氨酸含量是評價植物耐寒性的一個重要指標（Kishor et al.，2005）。田雲(yún)等（2017）研究表明低溫脅迫下黃瓜中脯氨酸的積累量明顯上升，且不同品種間有明顯差異?？扇苄蕴牵ㄕ崽?、果糖、棉子糖、水蘇糖等）可以提高細胞液濃度，降低細胞水勢和冰點，增強細胞持水能力和滲透調(diào)節(jié)能力，防止細胞脫水過度，提高細胞耐冷性，降低低溫對細胞的傷害（崔國文，2009）。蘇正楠（2017）研究表明可溶性糖的含量與黃瓜的抗寒指數(shù)呈正相關(guān)。黃瓜中轉(zhuǎn)錄因子ICE1過量表達可誘導(dǎo)冷脅迫基因的表達，促進可溶性糖和游離脯氨酸的積累，抑制丙二醛（MDA）的積累，從而提高黃瓜的耐冷性（Liu et al.，2010）。

1.5 光合特性

光合作用對黃瓜正常的生命活動起著重要的作用。孫世君（2018）研究表明，低溫脅迫不僅使黃瓜葉片的葉綠素含量（SPAD）降低，同時使葉片的凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度均隨溫度的下降而降低，但光能利用率相對較高。Hutchison等（2000）研究表明，低溫破壞Rubiso蛋白的完整性，葉片光合作用所需的Rubiso酶活性降低，光合能力下降，有機物的合成減少。邢瀟晨等（2017）研究表明，500～800 μmol·L-1的 DNA 甲基化抑制劑5-aza C處理黃瓜幼苗能夠顯著降低葉片細胞膜透性，提高葉片的凈光合速率，從而提高黃瓜幼苗的耐冷性。

2 植物響應(yīng)低溫信號的分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

植物在遭受低溫脅迫時，低溫信號在細胞膜上被受體識別、在細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)、并在細胞核內(nèi)產(chǎn)生一系列的調(diào)控應(yīng)答，從而調(diào)控耐冷基因表達，以增強植物耐低溫脅迫的能力（許英 等，2015）。

2.1 細胞膜感受低溫信號

細胞流動假說認為在低溫條件下，細胞膜上的感受器感受低溫信號，引起細胞膜的流動性下降，膜蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，細胞骨架由微管和細絲狀變?yōu)槭鵂畎l(fā)生重排，從而誘導(dǎo)冷誘導(dǎo)基因BN115的大量表達，提高GTPase的活性，激活細胞膜上的鈣離子通道打開，鈣離子從細胞外流入細胞質(zhì)（Plieth et al.，1999；Sangwan et al.，2010）。

2.2 低溫信號從細胞膜到細胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)

Ca2+是響應(yīng)低溫信號的主要第二信使，Ca2+與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子鈣結(jié)合蛋白結(jié)合，激活蛋白激酶（MAPKs）級聯(lián)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化，從而將低溫信號從細胞質(zhì)傳到細胞核（Kudla et al.，2018）。其中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要鈣結(jié)合蛋白有鈣調(diào)素（CaM）、鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）、鈣調(diào)磷酸酶（CALs）等（Zhu，2016）。

2.3 低溫信號在細胞核內(nèi)的調(diào)控

目前低溫信號在細胞核中的轉(zhuǎn)導(dǎo)機制在擬南芥和水稻中研究較多（Ding et al.，2019）。

在擬南芥中，冷信號在細胞核內(nèi)的調(diào)控主要有2種途徑：一是通過MAPKs級聯(lián)系統(tǒng)激活細胞核中的核心轉(zhuǎn)錄因子ICE1，絲裂原活化蛋白激酶3（MPK3）和絲裂原活化蛋白激酶6（MPK6）通過磷酸化ICE1以破壞ICE1蛋白的穩(wěn)定性，從而負調(diào)控冷調(diào)控基因CBF/COR的表達（Chinnusamy et al.，2007；Li et al.，2017）；二是低溫條件下，PP2C型E家族蛋白磷酸酶家族（EGR2）豆蔻酰化修飾后與N-肉豆蔻?；D(zhuǎn)移酶（NMT1）互作減弱，使得植物合成大量新的非豆蔻?；揎椀腅GR2（u-EGR2），u-EGR2干擾豆蔻化修飾的EGR2（m-EGR2）與 OST1（Open stomata 1）蛋白激酶的互作，激活OST1，OST1磷酸化轉(zhuǎn)錄因子ICE1并穩(wěn)定ICE1蛋白，正調(diào)控CBF/COR基因的表達，從而提高植物的耐冷性（Ding et al.，2015，2018a）。

在水稻中，低溫信號在細胞核內(nèi)的調(diào)控主要有3種途徑：一是活性氧（ROS）的積累引起MAPKs級聯(lián)系統(tǒng)調(diào)節(jié)OsbHLH002（ICE1同源蛋白）的活性，促進其靶基因OsTPP1在低溫下表達并將海藻糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化成海藻糖（Zhang et al.，2017）；二是通過Ca2+信號誘發(fā)轉(zhuǎn)錄因子OsMYB3R-2、OsMYBS3和OsMADS57過量表達，在轉(zhuǎn)錄水平上提高水稻的耐冷性（Ma et al.，2009；Su et al.，2010）；三是ABA的積累誘發(fā)ABA信號通路打開（Ding et al.，2018b）。以上三種途徑共同提高水稻的耐寒性。

目前，低溫信號的分子轉(zhuǎn)導(dǎo)機制在黃瓜中的研究較少，且尚不清楚。但國內(nèi)外對黃瓜耐低溫脅迫分子機制的有關(guān)報道為進一步研究黃瓜的低溫應(yīng)答提供了重要的理論依據(jù)。

3 黃瓜耐低溫脅迫的分子機制

3.1 黃瓜耐低溫遺傳規(guī)律和基因定位研究

重要農(nóng)藝性狀的基因定位是進行基因克隆和作物遺傳改良的基礎(chǔ)。作物的耐低溫能力很大程度上取決于遺傳因素。目前，很多作物中已經(jīng)定位及克隆了耐寒基因，比如擬南芥的cor78（Horvath et al.，1993）、大麥的pT59和pAO86（Cattivelli & Bartels，1990）、水稻的qLTG3-1（Fujino & Sekiguchi，2011）、玉米的GRMZM2G325653（Hu et al.，2016）等。但在黃瓜中與低溫相關(guān)的基因還未得到克隆。

有關(guān)黃瓜耐低溫的遺傳學(xué)研究表明，控制低溫下黃瓜發(fā)芽能力（相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數(shù)、相對胚根長度）的遺傳符合加性-顯性模型，以顯性效應(yīng)為主（紀穎彪 等，1997；顧興芳 等，2002）。目前對黃瓜芽期的耐低溫基因定位已有研究，Song等（2018）以65G（芽期低溫敏感型）和02245（芽期耐低溫型）為親本構(gòu)建重組自交系，通過兩次的遺傳分析表明芽期耐低溫符合數(shù)量遺傳，以127對SSR分子標記對RIL群體構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，檢測到3個與低溫相關(guān)的主效QTL位點：與低溫下發(fā)芽能力相關(guān)的位點qLTG1.1和qLTG2.1，與低溫下胚根伸長相關(guān)的位點qLTG4.1。

對黃瓜苗期的耐低溫基因定位也有報道，李恒松等（2015）以0839（黃瓜耐冷型品系）和B52（低溫敏感型品系）為親本，構(gòu)建6世代群體，遺傳分析表明幼苗耐冷基因受顯性單基因控制，通過對F2群體集群分離分析（BSA），將黃瓜幼苗耐冷性主效基因定位于黃瓜遺傳圖譜第6連鎖群上，與分子標記SSR07248的遺傳距離為32.6 cM。王紅飛（2014）以QT193（苗期低溫敏感型）和JD32（苗期耐低溫型）為親本，構(gòu)建F2遺傳群體，遺傳分析表明苗期耐冷基因符合數(shù)量性狀遺傳，以75對分子標記構(gòu)建連鎖遺傳圖譜，共檢測到4個與苗期耐低溫相關(guān)的位點，其中3個與冷害指數(shù)相關(guān)的位點（qCT-3-1、qCT-3-2、qCT-3-3）位于3號染色體，1個與恢復(fù)指數(shù)相關(guān)的位點（qCT-7-1）位于7號染色體。

3.2 黃瓜耐低溫相關(guān)基因及功能研究

目前在研究中發(fā)現(xiàn)多個基因的表達與黃瓜耐冷性密切相關(guān)。陳珊等（2015）發(fā)現(xiàn)CsHSF7和CsHSF11基因的表達水平與黃瓜果實耐冷性密切相關(guān)，且CsHSF11在酵母中具有轉(zhuǎn)錄激活活性；董洪霞等（2017）發(fā)現(xiàn)黃瓜中參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的Csa5M608380基因后期過量表達可能提高黃瓜的耐冷性。將甘氨酸豐富RNA結(jié)合基因CsGR-RBP3或G蛋白Gγ亞基的同源基因CsGG3.2過表達，活性氧清除系統(tǒng)加強，CAT和SOD活性提高，黃瓜幼苗的低溫傷害指數(shù)降低，黃瓜的耐寒性增強（Bai et al.，2018；Wang et al.，2018）。黃瓜中不同基因的表達水平對黃瓜低溫適應(yīng)起重要作用，低溫誘導(dǎo)下黃瓜葉片中水蘇糖合成酶基因（STS I、STS Ⅱ）（呂 建 國，2017）、α-半乳糖苷酶基因（AGA2、AGA3）（陸慢，2018）、根系FADs基因（CsFAD3、CsFAD7）（Dong et al.，2016）表達量上升；但根系的CsFAB2.1、CsFAB2.2、CsFAD5表達量下降（Dong et al.，2016）。

3.3 黃瓜中與低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制相關(guān)的研究

黃瓜中與低溫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要有AP2和WRKY家族。黃瓜AP2家族中有162個CBF基因。ABA的積累可以激活黃瓜幼葉中冷誘導(dǎo)基因CBF1的表達，提高黃瓜的耐冷性（Talanova et al.，2008）。黃瓜中有55個WRKY基因（CsWRKY），通過RT-PCR技術(shù)顯示CsWRKY21、CsWRK23、CsWRKY32、CsWRKY33、CsWRKY42、CsWRKY46和CsWRKY53等7個基因與黃瓜低溫脅迫有關(guān)，其中CsWRKY21、CsWRKY23在低溫條件下表達量上升（Ling et al.，2011；張穎，2012；張穎 等，2017）。低溫脅迫下，黃瓜細胞核中的CsWRKY46基因響應(yīng)低溫信號并過量表達，引起ABA含量的變化，CsWRKY46和ABA可能共同調(diào)節(jié)ABI5基因的表達，進而調(diào)節(jié)冷調(diào)控基因COR47、RD29A和KIN1表達，提高黃瓜的耐寒性（Zhang et al.，2016）。

目前黃瓜耐低溫基因功能的研究僅僅停留在轉(zhuǎn)錄水平層面，對于酶活性如何受低溫影響以及它們參與低溫響應(yīng)的分子機理尚需進一步研究。因此，探究黃瓜耐低溫響應(yīng)途徑及調(diào)控因子的研究對于黃瓜耐低溫脅迫反應(yīng)的分子機制研究具有非常重要的意義。

4 提高黃瓜低溫耐受性的主要措施

大量研究表明可以從多個方面提高黃瓜對低溫的耐受性。苗期經(jīng)過一段時間的低溫鍛煉可以提高其抗寒力（John et al.，2016）；提高營養(yǎng)液中微量元素（如Mo、Mg）的含量可以增強黃瓜幼苗的壯苗指數(shù)、滲透調(diào)節(jié)能力、抗氧化能力和氮代謝，減輕低溫對黃瓜幼苗光合機構(gòu)的傷害，從而提高幼苗的耐冷性（蔡歡，2014；黃紅榮 等，2017）；黃瓜幼苗葉面噴施外源物質(zhì)，如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（CaCl2、甜菜堿）（畢煥改 等，2015；李陽 等，2015）、激素類物質(zhì)（ABA、SA、GA）（白龍強 等，2016）、H2S（周超凡 等，2016）、GABA（γ-氨基丁酸）（黃娟 等，2014）、亞精胺（SPD）（李彬，2017）可以提高低溫耐受性；加強耐低溫砧木的篩選和改進嫁接技術(shù)，選擇合適的南瓜品種作砧木進行嫁接換根，可以促進低溫脅迫下接穗的生長，提高黃瓜的低溫耐受性（Xu et al.，2017）。

以上途徑是從外源提高黃瓜的低溫耐受性，而培育好的黃瓜品種可以從內(nèi)源提高黃瓜的耐寒性。育種工作者根據(jù)實際生產(chǎn)需求，通過挖掘耐冷基因和種質(zhì)資源等途徑培育出耐低溫新品種，如中農(nóng)26號、博耐30號、津優(yōu)35號、津優(yōu)36號等（顧興芳 等，2010；李平，2013；李靜 等，2019），從根本上提高黃瓜耐寒性。

5 展望

當今全球氣溫變暖，海平面上升，極端天氣頻發(fā)，低溫冷害已經(jīng)嚴重影響植物的生長和發(fā)育，給黃瓜的產(chǎn)量、品質(zhì)等帶來了極大的損失。研究黃瓜耐低溫的分子機制，選育低溫耐受的優(yōu)異黃瓜種質(zhì)是解決這一問題的最有效途徑。

隨著黃瓜基因組測序的完成及大量分子標記的開發(fā)，利用黃瓜全基因組分析，對黃瓜果實品質(zhì)的相關(guān)性狀已有大量研究（Huang et al.，2009），而對黃瓜耐冷基因的挖掘僅僅停留在芽期和苗期耐低溫性狀的遺傳分析和基因定位階段，對成株期和果實期的耐低溫性研究較少；此外，關(guān)于響應(yīng)低溫脅迫的基因研究尚停留在轉(zhuǎn)錄水平，尚未見黃瓜耐低溫基因的分子克隆及響應(yīng)低溫脅迫的信號通路研究。今后可以加強以下幾個方面的研究：① 進一步完善黃瓜芽期、苗期、成株期耐低溫評價方法；② 廣泛收集并系統(tǒng)鑒定國內(nèi)外黃瓜種質(zhì)資源，挖掘耐低溫的優(yōu)異種質(zhì)；③ 對黃瓜中參與抗逆的轉(zhuǎn)錄因子家族如AP2家族和WRKY家族進行系統(tǒng)研究，找到調(diào)控低溫脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子；④ 以模式植物擬南芥和水稻中的低溫信號通路為參考，挖掘黃瓜中參與低溫脅迫響應(yīng)信號通路的關(guān)鍵因子，構(gòu)建黃瓜響應(yīng)低溫脅迫的信號通路模型；⑤ 挖掘耐低溫基因，用基因編輯等生物技術(shù)手段創(chuàng)制新的耐低溫材料。