辣椒抗番茄斑萎病毒病研究進(jìn)展及展望

王 昆 張寶璽 張正海 曹亞從 于海龍 王立浩

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

辣椒番茄斑萎病毒病由番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）引起。TSWV 屬于布尼亞病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病屬（Orthotospovirus），是一種檢疫性植物病毒，起源于澳大利亞（Brittlebank，1915；Samuel et al.，1930），隨后逐漸蔓延到歐洲、非洲、北美洲和南美洲（Culbreath et al.，1991；Peters et al.，1996；Rosales et al.，2007）。近些年，在伊朗、日本、韓國和中國等亞洲中東和遠(yuǎn)東國家也發(fā)現(xiàn)了TSWV（Golnaraghi et al.，2001；Massumi et al.，2007；Lian et al.，2013）。TSWV 可侵染82 個(gè)科1 000 余種植物（Timmerman-Vaughan et al.，2014），20 世紀(jì)80、90 年代TSWV 在西班牙、美國、巴西、意大利等國家對(duì)番茄、萵苣、辣椒、花卉造成大面積減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)（Cho et al.，1987；Epinosa et al.，2002）。由于對(duì)植物危害嚴(yán)重，TSWV 在世界十大重要植物病毒排名中已居第2 位（Scholthof et al.，2011）。我國自1984 年首次在廣州發(fā)現(xiàn)TSWV 為害花生后，1987 年四川省首次報(bào)道了TSWV 為害番茄（蘇大昆 等，1987），隨后又在煙草、辣椒、馬鈴薯等多種作物中發(fā)現(xiàn)了TSWV（許澤永 等，1989；姚革，1992；丁銘 等，2004；張仲凱 等，2004）。

1 辣椒TSWV 的發(fā)生與分布

1.1 辣椒TSWV 的分布

從地理位置上來看，TSWV 的發(fā)生分布于熱帶、亞熱帶、溫帶等氣候帶（Accotto et al.，2000）。從發(fā)生季節(jié)來看，TSWV 在露地主要集中在夏季發(fā)生，在溫室內(nèi)呈現(xiàn)周年發(fā)生的趨勢(shì)，每年發(fā)病率差異不大，呈上升趨勢(shì)，但是增長(zhǎng)緩慢（張仲凱 等，2004；Kwon et al.，2016）。

1.2 國外辣椒TSWV 的發(fā)生情況

1984 年，TSWV 對(duì)巴西露地栽培的甜椒造成嚴(yán)重的為害，受害面積達(dá)69%以上（Cupertino et al.，1984）。1990 年意大利的Liguria 地區(qū)也因薊馬的發(fā)生導(dǎo)致辣椒TSWV 的大暴發(fā)，與此同時(shí)，美國中西部也有TSWV 對(duì)辣椒嚴(yán)重為害的報(bào)道（Latin et al.，1990；Lisa et al.，1990）。隨后在韓國、黑山、委內(nèi)瑞拉、厄瓜多爾等國家的辣椒生產(chǎn)中，TSWV 也相繼被發(fā)現(xiàn)且造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Mun et al.，2008；Zindovi? et al.，2011；Pérez-Colmenares et al.，2015；Sivaprasad et al.，2017）。目前，TSWV 已對(duì)南北美洲、歐洲、亞洲等地的辣椒生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。此外，在辣椒中還存在TSWV 和其他病毒混合侵染的情況（Boiteux et al.，1993；Kenyon et al.，2015）。

1.3 國內(nèi)辣椒TSWV 的發(fā)生情況

21 世紀(jì)初，西花薊馬在我國蔬菜作物中大規(guī)模暴發(fā)，一些專家提出應(yīng)警惕TSWV 伴隨西花薊馬的發(fā)生（王立浩，2003；張友軍 等，2003）。在辣椒中，TSWV 已先后在臺(tái)灣、廣州、重慶、天津等地區(qū)大面積發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失（劉勇等，2010；Zheng et al.，2010；呂要斌 等，2011；郭思瑤 等，2015；高葦 等，2016）。近些年來，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所辣椒遺傳育種課題組在北京周邊辣椒生產(chǎn)區(qū)多次檢出TSWV（未發(fā)表）。由于薊馬的大面積發(fā)生，TSWV 已經(jīng)在部分地區(qū)呈現(xiàn)高發(fā)信號(hào)（李飛，2013；鄭雪 等，2015）。

2 辣椒TSWV 的癥狀檢測(cè)

2.1 生物學(xué)方法

辣椒發(fā)生TSWV，其頂端葉片上有壞死的褪綠環(huán)斑或黃斑，沿葉柄或頂端表皮下的維管束變?yōu)楹稚珘乃阑蝽敹丝菟?，頂端生長(zhǎng)受抑制，嚴(yán)重時(shí)節(jié)間短縮，葉片壞死，植株矮化、黃化明顯。成熟果實(shí)黃化，伴有同心環(huán)或壞死條紋（Boiteux，1995；Ronde et al.，2013）。辣椒TSWV 病癥的產(chǎn)生不僅與病毒的致病因子和寄主的抗性基因產(chǎn)生的防御機(jī)制的相互作用有關(guān)，環(huán)境溫度、薊馬傳播介體的群體大小等也會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響（Louren??o et al.，1997；Stumpf &Kennedy，2007）。

2.2 血清學(xué)方法

利用抗原與抗體的體外特異性結(jié)合可以檢測(cè)病毒的原理，開發(fā)了包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)（GICT）、雙抗體夾心法（DASELISA）、三抗酶聯(lián)反應(yīng)吸附測(cè)定法（TAS-ELISA）和組織印跡法（Tissue blot-ELISA）等多種可應(yīng)用于TSWV 檢測(cè)的方法。利用ELISA 法可在無癥狀植株的葉片和根部檢測(cè)出TSWV（Soler et al.，1999）。在病害監(jiān)測(cè)早期，常利用ELISA 法監(jiān)測(cè)帶毒介體薊馬進(jìn)而提前控制病毒的傳播（Bandla et al.，1994；鄭寬瑜 等，2015；Huang et al.，2018）。

2.3 電子顯微技術(shù)

利用電鏡觀察病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其寄主的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，可對(duì)TSWV 進(jìn)行檢測(cè)。目前，主要通過負(fù)染色法、超薄切片法、免疫電鏡來實(shí)現(xiàn)TSWV的電鏡鑒定。利用電子顯微技術(shù)觀測(cè)寄主組織，確定病毒類型，在TSWV 鑒定上具有重要應(yīng)用價(jià)值（張仲凱 等，2000；王健華 等，2005；鄭元仙和劉雅婷，2009）。

2.4 分子生物學(xué)方法

現(xiàn)已開發(fā)出逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、多重RT-PCR 技術(shù)（multiple RT-PCR）、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）、免疫捕捉RT-PCR（IC-RT-PCR）、實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)、核酸序列依賴性擴(kuò)增技術(shù)（NASBA）等分子生物學(xué)方法，能夠?qū)崿F(xiàn)病毒的快速檢測(cè)，且重復(fù)性好。RT-PCR 技術(shù)被認(rèn)為是植物病原鑒定、植株病害診斷的革命性方法，可實(shí)現(xiàn)植株和薊馬上TSWV 的精準(zhǔn)檢測(cè)（Boonham et al.，2002；楊英華等，2011；Serena et al.，2012；吳興海等，2016；馮黎霞等，2017；李潔等，2017）。

3 TSWV 的傳播方式

TSWV 在自然條件下主要通過薊馬進(jìn)行傳播，此外也可通過機(jī)械摩擦、嫁接等方式傳播。

3.1 TSWV 的傳播載體

研究表明，薊馬是TSWV 傳播的主要媒介（Wijkamp et al.，1996）。目前有9 種薊馬可以傳播TSWV，包括西花薊馬（Frankliniella occidentalis）、番茄薊馬（F.schultzei）、褐花薊馬（F.fusca）、禾花薊馬（F.tenuicornis）、臺(tái)灣花薊馬（F.intonsa）、佛羅里達(dá)花薊馬（F.bispinosa）、首花薊馬（F.cephalica）、煙薊馬（Thrips tabaci）、豆薊馬（T.setosus）（Wijkamp et al.，1995；Naidu et al.，2001；Avila et al.，2006；Ohnishi et al.，2006），其中西花薊馬（F.occidentalis）是導(dǎo)致TSWV 在世界范圍內(nèi)大面積發(fā)生的主要媒介（Kirk &Terry，2003；Jones，2005；Riley et al.，2011；Rotenberg et al.，2015）。

3.2 西花薊馬的傳毒特性

西花薊馬屬纓翅目（Thysanoptera）薊馬科（Thripidae）花薊馬屬（Frankliniella），又稱苜蓿薊馬，分為卵、若蟲、蛹和成蟲4 個(gè)發(fā)育過程，生活史平均約為40 d，銼吸式口器，通過刮破植物表皮刺入組織內(nèi)部吸食汁液為害（Whitfield et al.，2005）。只能通過若蟲獲毒，獲取時(shí)間30 min，若蟲的蟲齡越小獲毒能力越強(qiáng)（Nagata et al.，1999）。TSWV 在寄主和介體體內(nèi)都有復(fù)制能力。通常，在若蟲體內(nèi)病毒需要經(jīng)過72 h 以上的復(fù)制后才能傳毒。病毒先存在于西花薊馬的中腸，然后進(jìn)入唾腺，排毒時(shí)間為5 min 左右，屬于持久性排毒類型（許志剛，1978）。攜毒西花薊馬的傳毒能力可保持22～30 d（Wijkamp et al.，1996）。

4 辣椒TSWV 的防治方法

4.1 選育抗性品種

利用小孢子、原生質(zhì)體融合、分子標(biāo)記輔助育種、種間雜交等技術(shù)可實(shí)現(xiàn)抗病資源創(chuàng)新和新品種選育。現(xiàn)已在甜椒中選育出抗性材料0516（Tsw），表現(xiàn)出良好的TSWV 抗性（王立浩 等，2016）。

4.2 防治傳播媒介

由于薊馬對(duì)TSWV 的傳毒特性，對(duì)薊馬的防治也是非常的必要?？刹捎梦锢矸乐危ㄗ贤夥瓷涔飧采w膜）、化學(xué)防治（吡蟲啉、阿克泰等內(nèi)吸性殺蟲劑）等消滅越冬蟲源，減少春季蟲源等方法控制薊馬的為害和暴發(fā)（Momol et al.，2004；Chatzivassiliou et al.，2008）。

4.3 加強(qiáng)田間管理

田間雜草也是TSWV 的主要寄主植物，及時(shí)清除田間雜草、拔除發(fā)病植株等都是重要的防治方法（孔凡玉，2002）。

5 辣椒抗TSWV 育種

5.1 辣椒抗TSWV 的種質(zhì)資源

由于TSWV 的株系分化能力極強(qiáng)，因此尋找更多的抗性資源變得越來越迫切。目前報(bào)道的辣 椒TSWV 抗病材料有PI152225、PI159236、CNPH275、PI15、C00943 和7204 等（Black et al.，1991；Boiteux &Giordano，1993；Boiteux &ávila，1994；Hobbs et al.，1994；Nuez et al.，1994）。研究發(fā)現(xiàn)，Capsicum baccatumPIM26-1 對(duì)TSWV 及其Tsw-RB 突變株系有更高的抗性（Persley et al.，2006；Hoang et al.，2013；Soler et al.，2015）。由于Tsw是單顯性基因遺傳、TSWV 分化變異頻率高、全球氣候變暖等原因，辣椒不同類型TSWV 抗病資源的挖掘十分重要（Farnham &Baulcombe，2006；Massimo et al.，2016）。

5.2 TSWV 的抗性基因定位及分子標(biāo)記的開發(fā)

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展及辣椒全基因組測(cè)序的完成，辣椒抗TSWV 基因定位及其分子標(biāo)記的開發(fā)也取得了重要進(jìn)展。Jahn 等（2000）利用BC4群體獲得了1 個(gè)與抗性基因共分離的RAPD 標(biāo)記Q-06270，該標(biāo)記位于辣椒10 號(hào)染色體，與抗性位點(diǎn)遺傳距離2.1 cM。Moury 等（2000）利用F2群體（PI52225×PI195301），獲得了4 個(gè)與抗性基因共分離的RAPD 標(biāo)記，并將標(biāo)記OPAC10593 轉(zhuǎn)化為CAPS 標(biāo)記（SCAC568），與Tsw位點(diǎn)的遺傳距離為0.87 cM，可用于后期TSWV 抗性分子鑒定。Kim 等（2016）利用SNP 標(biāo)記將Tsw位點(diǎn)定位于295 kb 區(qū)間內(nèi)，并獲得了7 個(gè)與抗性基因Tsw緊密連鎖的SNP 標(biāo)記（SNP246056-1、SNP246056-2、SNP246056-3、SNP246056-4、SNP653492-1、SNP653492-2、SNP653492-3），利用轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，最終將CcNBARC575作為Tsw候選基因，該基因編碼CNL 型蛋白。

5.3 抗TSWV 育種的分子機(jī)制

研究表明，辣椒植株通過對(duì)TSWV 產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive response，HR），來實(shí)現(xiàn)TSWV 抗性（Boiteux，1995）。辣椒的Tsw基因抗性分子機(jī)制與番茄中Sw-5b介導(dǎo)的TWSV 抗性機(jī)制不同。Tsw的抗性需要NSs 蛋白編碼的無毒沉默抑制子來引發(fā)HR 反應(yīng)。而番茄需要NSm編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白作為無毒因子參與Sw-5的相互識(shí)別來誘導(dǎo)HR 反 應(yīng)（Ronde et al.，2013；Hallwass et al.，2014；Ocampo et al.，2016；Jiang et al.，2017）。

6 展望

在“TSWV-薊馬-寄主”模式中，基因、蛋白之間的互作以及防御機(jī)制信號(hào)通路的研究仍然不夠清楚，分子生物學(xué)、生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)在分子層面揭示TSWV 感染經(jīng)濟(jì)作物的機(jī)制是一個(gè)重要的契機(jī)，這也將會(huì)為防治TSWV、消除TSWV 對(duì)經(jīng)濟(jì)作物的危害產(chǎn)生巨大的貢獻(xiàn)。

辣椒TSWV 株系分化快速。攜帶Tsw基因的品種推廣后，在巴西很快就有抗性菌株的報(bào)道，隨后在意大利、西班牙、澳大利亞等國家也有相關(guān)報(bào)道（Boiteux &Nagata，1993；Roggero et al.，2002；Thomas-Carroll &Jones，2003；Margaria et al.，2004，2007，2014；Sharman &Persley，2006；Karavina et al.，2016）。中國云南地區(qū)的辣椒中TSWV-YN18 和TSWV-YN53 株系可以免疫Tsw的抗性，發(fā)現(xiàn)其NSs 蛋白不能介導(dǎo)HR 反應(yīng)（Jiang et al.，2017）。

TSWV 對(duì)國內(nèi)外的辣椒生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，最有效的應(yīng)對(duì)方法就是培育抗TSWV 的辣椒品種，而TSWV 突變株系的不斷產(chǎn)生又對(duì)當(dāng)前的育種工作提出嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，在辣椒育種中利用抗性基因Tsw，同時(shí)尋找廣譜抗性基因、培育抗性持久的品種是今后育種工作的一個(gè)重要方向。