非洲豬瘟的樣品采集

文│中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

非洲豬瘟（ASF）的任何實(shí)驗(yàn)室檢測都始于樣品采集。樣品采集過程中重要的考慮因素是調(diào)查的目的，例如診斷、監(jiān)測或無疫認(rèn)證。對(duì)哪些動(dòng)物采樣將取決于抽樣的目的。例如，當(dāng)調(diào)查疫情暴發(fā)（被動(dòng)監(jiān)測）時(shí)，應(yīng)對(duì)針對(duì)患病和死亡動(dòng)物，而在檢查動(dòng)物是否暴露于病原（主動(dòng)監(jiān)測）時(shí)，應(yīng)對(duì)年齡最大的動(dòng)物進(jìn)行抽樣。

負(fù)責(zé)抽樣（并進(jìn)行臨床檢查）的人員在開展相關(guān)操作前應(yīng)該接受過保定豬的技術(shù)培訓(xùn)（包括臨床檢查和取樣）。

采樣小組應(yīng)根據(jù)采樣動(dòng)物的數(shù)量準(zhǔn)備充足的采樣設(shè)備。

這些實(shí)用指南是針對(duì)現(xiàn)場和實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì)制定的（譯者：具體操作應(yīng)首先符合我國相關(guān)規(guī)定）。

一、采樣所需材料

一般材料：標(biāo)簽和永久的記號(hào)筆；數(shù)據(jù)記錄表、筆、寫字板；盛放針和刀片的利器盒；高壓滅菌處理袋。

個(gè)人保護(hù)設(shè)備（PPE要求將有所不同，例如監(jiān)測與暴發(fā)調(diào)查）：專用服裝（防護(hù)服）；橡膠靴；鞋套；手套；面罩；護(hù)目鏡；洗手的消毒劑；清洗靴子的消毒劑。

樣品運(yùn)輸?shù)牟牧希夯镜娜萜?管/小瓶（防漏并標(biāo)示清楚）；吸水材料；能夠耐受95KPa的，最好是塑料材質(zhì)的容器或袋子，作為密封性的2次包裝（即防漏）、用于儲(chǔ)存每只動(dòng)物樣品的容器和采血管；冷藏箱（4℃），汽車電池驅(qū)動(dòng)為優(yōu)選，例如，填充有冷卻材料的聚苯乙烯泡沫塑料盒（例如冰、冷凍水瓶或適當(dāng)?shù)睦浒b，如能使所需溫保持長達(dá)數(shù)天的具有特殊冷凝膠的一些商品化冰袋）；便攜式-80℃冷凍箱/干冰/液氮罐（僅在距離設(shè)備齊全的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行取樣時(shí)才需要）。在運(yùn)輸樣品時(shí)，必須要始終保持上述“三重”安全結(jié)構(gòu)的包裝。

活體動(dòng)物采樣的材料：保定動(dòng)物的材料（如套索、木板）；清潔采樣處所需的消毒劑和脫脂棉；采血用的不含抗凝劑的無菌采血管（10毫升）（紅色蓋子）；采集抗凝血的含有EDTA的無菌采血管（10毫升）（紫色蓋子）；根據(jù)豬的大小和采樣部位（頸靜脈、耳緣靜脈）選取真空采血管或10～20毫升真空針頭注射器；濾紙/干血斑（DBS）卡。

尸體采樣所需的材料：樣品架或凍存盒；用于收集病料的無菌2毫升凍存管（如果無法滿足冷鏈運(yùn)輸，可以提前加入RNA保護(hù)劑，以便于樣品的保存）；刀、磨刀器、剪切機(jī)、帶刀片的手術(shù)刀、鉗子和剪刀；盛有消毒劑用于對(duì)刀、剪刀進(jìn)行消毒的容器，從而避免不同臟器和不同動(dòng)物個(gè)體之間的交叉污染；可密封的塑料容器，裝滿10%中性福爾馬林緩沖液（動(dòng)物臟器體積∶福爾馬林體積比為1∶10）；處置動(dòng)物尸體所需的適當(dāng)材料。并包含可能由于其他原因（例如，失效的真空采血管）而丟失或不可用的材料數(shù)量。另外，數(shù)據(jù)收集、個(gè)人防護(hù)/生物安全和樣品運(yùn)輸?shù)奈锲繁仨毎b。

建議準(zhǔn)備一份現(xiàn)場采樣表格，以便將現(xiàn)場收集所有樣品和相關(guān)信息統(tǒng)計(jì)到一起。如果預(yù)期將樣品提交給區(qū)域/國際參考實(shí)驗(yàn)室，建議一式兩份取樣，以便對(duì)提交的樣品進(jìn)行留樣，避免在反復(fù)凍融或分割樣品。

取樣應(yīng)小心謹(jǐn)慎，并按照適當(dāng)?shù)姆椒ū苊鈱?duì)動(dòng)物造成過度的應(yīng)激或傷害，或?qū)Σ蓸尤藛T造成傷害。應(yīng)無菌收集并注意避免交叉污染，并始終使用新的針頭以避免疫病傳播。所有等待檢測的樣品都應(yīng)該被認(rèn)為有感染性并應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)處理。養(yǎng)殖場使用的所有采樣材料應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)進(jìn)行安全處理，例如，裝袋并運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行高壓滅菌或適當(dāng)處置。

提交到診斷實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)樣品應(yīng)有清晰且保存持久的標(biāo)簽，樣品質(zhì)量良好。

二、樣品類型

1.全血。使用含有抗凝血?jiǎng)‥DTA-紫色蓋）的無菌管（真空采血管）從頸靜脈、下腔靜脈或耳靜脈抽取全血。如果動(dòng)物已經(jīng)死亡，可以從心臟中采血，但必須立即進(jìn)行。避免使用肝素（綠色蓋子），因?yàn)槠淇梢砸种芇CR反應(yīng)（造成假陰性）或由于紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（HAD）造成假陽性的產(chǎn)生。血液是PCR檢測和病毒分離的目標(biāo)樣品。通過離心分離出的血漿可以用間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)（IPT）或間接熒光抗體（IFA）試驗(yàn)進(jìn)行抗體的檢測。

通過干血斑（DBS）進(jìn)行微量體積血液樣品的采集和儲(chǔ)存，以便進(jìn)一步進(jìn)行DNA和（或）抗體檢測。這些卡片在偏遠(yuǎn)地區(qū)或者在無法冷鏈運(yùn)輸?shù)臅r(shí)候很有幫助，比如在熱帶地區(qū)的狩獵環(huán)境和農(nóng)村地區(qū)。然而，使用干血斑（DBS）進(jìn)行非洲豬瘟檢測時(shí)，基因組和（或）抗體檢測測試的靈敏度低于全血或血清樣品。通過將幾滴由刺血針或無菌注射器針頭從動(dòng)物的靜脈或皮膚滴加到特制的吸水濾紙中完成干血斑（DBS）樣品的收集。血液樣品應(yīng)該完全浸透在濾紙，并風(fēng)干數(shù)小時(shí)。將樣品儲(chǔ)存在低透氣性的塑料袋中，加入干燥劑以減少濕度，即使在熱帶氣候下也可以保持在環(huán)境溫度中。

2.血清。使用未加抗凝劑（紅色蓋子）的真空采血管從頸靜脈、下腔靜脈、耳緣靜脈，或剖檢過程收集血液樣品。返回實(shí)驗(yàn)室后，血液樣品應(yīng)在4±3℃下放置14～18小時(shí)以分離血凝塊（譯者：此處與我國實(shí)際操作不同，僅供參考）。棄去凝固物，并離心10～15分鐘后，回收澄清的上清液（血清）。如果血清是紅色，這表明樣品發(fā)生了溶血，可以在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）中產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。通常已經(jīng)死亡動(dòng)物的血液樣品易發(fā)生溶血（例如野豬）。血清樣品在分離后可以立即開展抗體和病毒檢測，或者在-70℃以下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?duì)于抗體檢測，儲(chǔ)存在-20℃已足夠，但是對(duì)于病毒檢測，最好存于更低溫度。

3.器官和組織樣品。雖然所有的豬器官和組織都可以用來檢查ASFV的存在（主要是該病的急性和亞急性的形式），但目標(biāo)器官是脾臟、淋巴結(jié)、肝臟、扁桃體、心臟、肺和腎臟。其中，脾臟和淋巴結(jié)是最重要的，因?yàn)橥ǔＫ鼈兊牟《竞渴亲罡叩?。骨髓也可用于死亡野生?dòng)物病例，因?yàn)槿绻麆?dòng)物已經(jīng)死了一段時(shí)間，則骨髓可能是唯一相對(duì)保存完好的組織?？梢酝ㄟ^關(guān)節(jié)內(nèi)組織液以檢查低毒力毒株的存在。建議將樣品保持在4℃，盡快（48小時(shí)內(nèi)）提交給實(shí)驗(yàn)室。如果由于物流原因無法保障的，樣品可以儲(chǔ)存在冷庫或液氮中。對(duì)于組織病理學(xué)研究，也可以同時(shí)提交用10%緩沖福爾馬林浸泡的樣品。雖然這些樣品不能用于進(jìn)一步的病毒分離研究，但可用于PCR反應(yīng)和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。

通過PCR反應(yīng)、病毒分離和（或）抗原檢測ELISA的方法進(jìn)行病毒檢測時(shí)，需要將樣品用磷酸鹽緩沖液制備成10%（w/v）的均質(zhì)組織懸液。在離心后，建議對(duì)上層清液進(jìn)行過濾，并用0.1%的抗生素在4±3℃處理1小時(shí)。經(jīng)過勻漿處理組織可以立即用于ASFV病毒和（或）核酸的檢測，或存儲(chǔ)在-70℃以下備用。對(duì)于PCR反應(yīng)，建議對(duì)10倍稀釋樣品或上清進(jìn)行檢測的同時(shí)，對(duì)未稀釋樣品也進(jìn)行檢測。從脾臟、肝臟和肺等臟器中提取的滲出物對(duì)于使用免疫過氧化物酶試驗(yàn)（IPT）和間接熒光抗體試驗(yàn)（IFA）方法檢測抗體非常有用（Gallardo，2015）。

4.軟蜱樣品。鈍緣蜱屬軟蜱可以用于檢測ASFV和病毒基因組?？蓮酿嘭i的洞穴、裂縫、洞穴中收集蜱蟲，有時(shí)也可以從豬圈內(nèi)的嚙齒類動(dòng)物的洞穴中收集。不同種類的蜱會(huì)有不同偏好的場所和棲息地。有三種收集技術(shù)：手動(dòng)收集、二氧化碳誘捕和真空吸引捕捉。收集后，應(yīng)讓蜱保持存活或直接儲(chǔ)存在液氮中，以確保蜱內(nèi)病毒的保存完好，并避免DNA降解。

目標(biāo)樣品的最小需求量。對(duì)于使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的抗體檢測以及驗(yàn)證性試驗(yàn)，建議的最小劑量為：血清500微升。對(duì)于使用PCR反應(yīng)和病毒分離的方法檢測非洲豬瘟（ASF）病毒時(shí)：血清1毫升；血液（EDTA-血液）1毫升；沒有福爾馬林的器官（推薦的最低量）5克。（注：本文節(jié)選自《聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）動(dòng)物生產(chǎn)及衛(wèi)生手冊(cè)》）