高效液相色譜法測定桑葉γ-氨基丁酸和谷氨酸

諶珍，劉青茹，張曉偉，賀晶，孫軍燕，劉婧，*

（1.中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016；2.煙臺北方茶葉推廣中心，山東煙臺264009）

近年來，以 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）為功效因子的新型功能食品被廣泛開發(fā)應用，GABA具有降壓、治療癲癇、增強記憶力等功效，而一般植物組織中的GABA含量很低，不能滿足人體生理需求，桑葉為藥食兩用原料，具有明顯的降血壓和降血糖功效，特別是其中所含的GABA含量平均能達到226 mg/100 g[1]，而且我國桑葉種植廣泛，是用來開發(fā)高γ-氨基丁酸茶的理想原料。桑葉中GABA是谷氨酸（glutamic acid，Glu）在谷氨酸脫羧酶的作用下水解而來，葉片中谷氨酸的含量也可以作為一個參照指標評價桑葉中γ-氨基丁酸提高的潛力。所以準確、高效測定桑葉中γ-氨基丁酸和谷氨酸的含量對于開發(fā)高γ-氨基丁酸桑葉茶尤為重要。

目前常用的測定γ-氨基丁酸的的方法主要分為高效液相色譜法[2-3]、Berthelot比色法[4-7]、改良紙層析法[8-9]。若采用紙層析法和比色法，因為桑葉內質成分復雜且含大量色素，會干擾γ-氨基丁酸和谷氨酸的測定，從而降低檢測的精確性和靈敏度。而高效液相法測定結果準確，靈敏度高，可同時檢測多種氨基酸。常用氨基酸柱前衍生試劑有異硫腈酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB），PITC衍生時間短但操作繁雜，需要減壓蒸餾去除多余衍生劑；OPA衍生反應迅速，但生成物不穩(wěn)定，需快速進樣，所以本試驗選用2，4-二硝基氟苯作為衍生試劑，用高效液相色譜法同時測定γ-氨基丁酸和谷氨酸含量。同時簡化樣品前處理過程，確立提取的最佳參數，旨在建立準確、高效的γ-氨基丁酸和谷氨酸檢測方法，為γ-氨基丁酸桑葉茶開發(fā)和利用提供理論與技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：新鮮桑葉、中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院食品技術所自制GABA桑葉茶。

γ-氨基丁酸標準品（99%）、三乙胺、三水乙酸鈉（均為分析純）：阿拉丁公司；乙腈（色譜純）：德國默克股份兩合公司；乙酸：國藥集團化學試劑有限公司；谷氨酸鈉（食用級）：河南思遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀（配Waters 1525泵、Waters717 plus自動進樣器、Waters 2487紫外檢測器）：美國Waters公司；DU-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；XW-80A旋渦混合器：上海精科實業(yè)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1）2，4-二硝基氟苯衍生溶液、pH 9.0硼酸緩沖溶液和pH 7.0磷酸緩沖溶液的配制參照文獻[10]。

2）梯度洗脫溶液

A相：50 mmol/L pH 6.8乙酸鈉緩沖溶液，（含1%三乙胺）。稱取3.402 g三水乙酸鈉，用娃哈哈純凈水定容至500 mL，加入0.5 mL三乙胺，0.5 mL冰乙酸，有機濾膜過濾，并超聲脫氣20 min。

B相：50%乙睛水溶液，體積比為1∶1。有機濾膜過濾，并超聲脫氣20 min。

1.3.2 衍生、上樣

取 200 μL 待測液，加 200 μL 硼酸鈉緩沖液，20 μL DNFB，封口膜密封，混勻，60℃暗處水浴1 h。室溫冷卻，加400 μL磷酸鹽緩沖液，搖勻，過 0.22 μm膜。

用pH 9.0硼酸緩沖溶液配制0.01、0.02、0.03mg/mL谷氨酸和γ-氨基丁酸混合標準溶液，其余操作待測液。

1.3.3 色譜條件

流速1 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫23℃；進樣量10 μL。梯度洗脫，洗脫程序參照文獻[11]。

1.3.4 樣品提取試驗

分別稱取桑葉茶粉 0.05、0.1、0.3、0.6、1.2 g 置于15 mL離心管中，加10 mL沸水，100℃水浴20 min，每5 min搖晃一次。冷卻至室溫，3 500 r/min離心10 min，上清轉移至25 mL容量瓶。重復提取一次，合并提取液定容至25 mL。按照提取所用溶劑體積20 mL計算料液比，考察料液比 2.5∶1、5∶1、15∶1、30∶1、60∶1（mg/mL）對GABA和Glu提取量的影響；在料液比5∶1（mg/mL）的基礎上，探究提取溫度70、80、90、100℃對 GABA和Glu 提取量的影響；在料液比 5∶1（mg/mL）與提取溫度80℃基礎上，設定單次提取時間分別為10、15、20、25 min，考察提取時間對GABA和Glu提取量的影響。

1.3.5 線性檢驗

用pH9.0硼酸緩沖液配制0～0.05 mg/mL質量濃度的混標，分別取200 μL進行衍生和色譜分析，測試結果以質量濃度為x軸，峰面積為y軸作線性方程，并進行線性回歸分析。

1.3.6 精確性和準確性驗證試驗

樣品重復性試驗：按上述方法處理桑葉茶，重復測定5次，計算測定結果得平均值和相對標準偏差。

樣品加標回收率：以桑葉茶為空白，添加已知質量濃度的氨基酸標準溶液，按照上述方法進行色譜測定，計算其加標回收率。

1.3.7 桑葉富集GABA實施方案

每2 m2的桑樹地澆10 L的濃度為5%谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）溶液，桑樹栽種株間距0.5 m，行間距1 m。7天后采樣，同時重復上述操作，過7天后再采樣。采樣分上位葉（2葉～4葉）、中位葉（6葉～8葉）、下位葉（倒數三葉）。

2 結果與討論

2.1 樣品提取參數優(yōu)化

樣品中GABA和Glu提取率的高低直接影響檢測方法的準確性，本文從提取料液比、時間、溫度幾個方面對提取過程進行優(yōu)化。GABA和Glu都極易溶于熱水，所以選擇以蒸餾水為提取溶劑，加熱浸提的方式。

2.1.1 料液比

料液比對Glu和GABA提取量的影響見圖1。

圖1 料液比對Glu和GABA提取量的影響Fig.1 The effect of solid-liquid ratio on the extraction of Glu and GABA

此處料液比為樣品質量與兩次提取總溶劑提取之比，通過圖 1 可以看出，料液比為 5∶1（mg/mL）時提取的Glu和GABA含量最高，Glu含量為（0.65±0.02）mg/g，GABA 為（1.92±0.02）mg/g，在 2.5 mg/mL 時稍低但差異不顯著；從料液比 5∶1（mg/mL）之后，GABA和Glu含量均隨料液比的增大而降低，可能原因是樣品多溶劑少導致提取不完全；總體上Glu與GABA提取率的變化趨勢一致，且料液比5∶1（mg/mL）提取效果最佳。

2.1.2 提取溫度

提取溫度對Glu和GABA提取量的影響見圖2。

提取溫度影響提取效率，試驗通過以不同溫度對桑葉進行提取，結果顯示，70℃提取的Glu與GABA含量顯著低于其他試驗組，80℃到100℃變化不大，同時Glu與GABA提取含量的變化趨勢一致，最終選取提取溫度80℃。

2.1.3 提取時間

提取時間對Glu和GABA提取量的影響見圖3。

圖2 提取溫度對Glu和GABA提取量的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the extraction of Glu and GABA

圖3 提取時間對Glu和GABA提取量的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction of Glu and GABA

提取總時間按照兩次浸提時間之和，由圖3可以看出，Glu和GABA提取量隨時間延長變化均不顯著，Glu含量在（0.59±0）mg/g到（0.61±0.01）mg/g之間，GABA 含量在（1.85±0.06）mg/g到（1.92±0.02）mg/g之間，所以選取提取時間10 min。

綜合上述試驗結果，料液比、提取溫度對Glu和GABA提取效果有較大影響，通過不同參數比較，確定最佳提取條件為：80℃條件下，料液比5∶1（mg/mL），分兩次浸提，每次5 min。

2.2 線性檢驗

Glu和GABA濃度與峰面積線性回歸關系見圖4、圖5。

圖4 Glu濃度與峰面積線性回歸關系Fig.4 The linear regression relationship between Glu concentration and peak area

圖5 GABA濃度與峰面積線性回歸關系Fig.5 The linear regression relationship between GABA concentration and peak area

試驗設置不同質量濃度的Glu和GABA標準溶液，結果顯示在0～0.05 mg/mL范圍內Glu的線性方程為y=2×107x-7 997.2，GABA的線性方程為y=2×107x+6 418.4，兩者的相關系數分別為0.998 9、0.999 5，線性關系良好。

圖6為標樣中Glu和GABA的液相色譜圖。

2.3 穩(wěn)定性檢驗

重復性試驗是評價分析系統穩(wěn)定性的重要方法，通常采用樣品保留時間和峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）作為考察對象。選用同一樣品連續(xù)進樣5次，結果如表2。

圖6 標樣中Glu和GABA分離圖譜Fig.6 The separation spectrogram of Glu and GABA in standard sample

表2 重復性檢驗（n=5）Table 2 The repetition test of retention time and peak area

通過表2可以看出，Glu的保留時間在9 min～10 min，相對標準偏差為1.759%，GABA的保留時間在33 min～34 min，相對標準偏差為0.718%；另外Glu和GABA的峰面積的相對標準偏差分別為1.672%、1.246%，均小于5%，說明此檢測方法的精密度達到了較高水平。

2.4 加標回收率

在同一份桑葉茶樣品中，分別添加0.005、0.01mg/mL的氨基酸標準溶液，按照上述方法進行測定，計算其加標回收率，結果如表3。

表3 加標回收率Table 3 Rate of recovery of Glu and GABA adding to the sample

經計算Glu和GABA的平均加標回收率分別為88.024%、114.64%，回收率在80%～120%之間，說明此方法具有較高的可靠性。

2.5 樣品測定

以富集GABA的桑樹鮮葉為樣品，按照上述方法進行測定，結果見表4。

表4 桑葉樣品中Glu和GABA含量Table 4 The content of Glu and GABA in mulberry leaf samples

由表4可以看出，通過給桑樹澆灌谷氨酸鈉溶液，桑葉谷氨酸含量自第一次澆灌后即有明顯增加，不同葉位之間含量相差不大；二次澆灌后桑葉中谷氨酸含量與一次澆灌基本保持一致，說明桑樹對谷氨酸鈉的吸收可能具有一定限度或者一部分流失或轉化成其他形式。而GABA含量在一次澆灌后上升幅度較小，二次澆灌后含量顯著提高，說明通過澆灌谷氨酸鈉溶液對GABA富集效果好，且轉化過程需要一定時間，后續(xù)可對其吸收轉化機制進行更深入的試驗。

3 結論

本研究通過對桑葉前處理的摸索，確定最佳提取條件為：80 ℃條件下，料液比 5∶1（mg/mL），分兩次浸提，每次5 min。建立了一種快速、簡單、精準的同時測定桑葉源谷氨酸和γ-氨基丁酸的方法，該方法能有效分開目標物質與干擾物質，且Glu和GABA的峰面積的相對標準偏差分別為1.672%、1.246%，平均加標回收率分別為88.024%、114.64%，具有較高的可靠性。另外試驗所用的紫外檢測器比熒光檢測器普及率高，具有更高的通用性。

采用此檢測方法測定富集GABA的桑葉中Glu和GABA含量，發(fā)現通過澆灌谷氨酸鈉可以達到較好的富集效果，為提高GABA含量提供可靠、快速的檢測手段，后續(xù)還可深入探究桑樹對谷氨酸鈉的吸收及轉化機制。