響應(yīng)面優(yōu)化提取龍牙楤木中總黃酮的工藝研究

徐洪宇，蒯宜蘊，趙烊，臧梁，蘇航，任重遠

（吉林化工學院生物與食品工程學院，吉林吉林132022）

龍牙楤木[Aralia elata（Miq.）Seem.]，又名刺老芽，系五加科楤木屬。其嫩莖葉常作山野菜食用，風味清香獨特，味美可口，營養(yǎng)豐富，富含人體所需要的16種以上營養(yǎng)元素以及多種氨基酸[1-2]。研究表明龍牙楤木水提物具有可預(yù)防白內(nèi)障的功效[3]。近年來對龍牙楤木中皂苷類成分研究較為深入，迄今，100余種皂苷已從龍牙楤木各部位被分離鑒定[4-6]。姚麗琴等[7]對比Plackett-Burman設(shè)計聯(lián)用CCD效應(yīng)面法和正交試驗設(shè)計，優(yōu)化龍牙楤木藥材中皂苷元齊墩果酸的水解工藝，在此2種方法的最佳工藝下，最終所得齊墩果酸質(zhì)量相差不大。吳舜等[8]通過Box-Behnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析，優(yōu)化龍牙楤木芽多糖提取工藝參數(shù)，優(yōu)化條件下龍牙楤木芽多糖平均提取率為5.87%。

生物黃酮是一種天然活性成分，因其降血糖、降血壓等功效日益受到人們的關(guān)注[9]。具有生物黃酮物質(zhì)的保健品具有活性高、見效快等特點，深受現(xiàn)代追求“綠色健康”理念人群的喜愛，因此近年來有關(guān)植物中天然產(chǎn)物的活性成分的相關(guān)研究較多[10]。龍牙楤木作為傳統(tǒng)醫(yī)藥中的藥用植物，其中的活性成分可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)等運轉(zhuǎn)發(fā)揮作用；在代謝綜合癥和血液凝固中能夠降血脂和抗糖尿病[11]。因此本文以龍牙楤木嫩芽為試驗材料，以總黃酮提取率為指標，優(yōu)化其提取工藝參數(shù)，以期為龍牙楤木總黃酮的開發(fā)研究提供參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

龍牙楤木嫩芽：六月中旬采自吉林長春，45℃烘干，粉碎過80目篩，備用。

蘆丁對照品：上海士鋒科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；無水乙醇、無水氯化鋁、甲醇、乙酸鉀：均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100型高速萬能粉碎機、DK-98-IIA型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；FA1004A型電子天平：上海精天電子儀器有限公司；80-2型電動離心機：金壇市華城開元實驗儀廠；722S可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 工藝流程

龍牙楤木嫩芽→干燥→粉碎過篩→乙醇溶液提取→恒溫水浴→離心過濾→取上清液→測定吸光度→計算總黃酮提取率

2.2 試驗設(shè)計

分析乙醇濃度（%）、提取溫度（℃）、提取時間（min）、料液比（g/mL）4個單因素對龍牙楤木總黃酮提取率影響的試驗結(jié)果，確定其中的3個影響因素并建立響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ汀?/p>

2.3 繪制蘆丁標準曲線

采用AlCl3法測定龍牙楤木總黃酮的含量，配制不同濃度的蘆丁溶液為對照品，于420 nm處測定吸光值。標準曲線以蘆丁質(zhì)量濃度x（mg/mL）為橫坐標，吸光度y為縱坐標，得到標準曲線方程y=0.563 4x+0.073 2（R2=0.999 2）。

2.4 總黃酮的提取及提取率測定

準確稱取0.500 g過篩后龍牙楤木粉于10 mL離心管中，以不同濃度乙醇作為提取劑，混勻液料后置于恒溫水浴鍋中，以不同溫度進行水浴浸提，完成后將浸提液離心過濾，濾液置于50 mL容量瓶中，測定其吸光值后參照蘆丁標準曲線測定其總黃酮含量，由此計算龍牙楤木總黃酮提取率率。

2.5 單因素試驗提取總黃酮[12-13]

不同乙醇濃度：取龍牙楤木粉樣品9份，每份樣品0.500 g，放入試管中，依次加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液10 mL，在60℃條件下，水浴提取30 min，離心過濾，收集溶液，提取液定容，按2.4節(jié)方法測定提取率。

不同提取溫度：取龍牙楤木葉粉樣品5份，每份樣品0.500 g，放入試管中，加入濃度為70%的乙醇10 mL，分別在 40、50、60、70、80 ℃條件下，水浴提取 30 min，離心過濾，收集溶液，提取液定容，測定提取率。

不同料液比：取龍牙楤木粉樣品6份，每份樣品0.500 g，放入試管中，依次加入濃度為70%的乙醇2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 mL，在 60 ℃條件下回流提取30 min，離心，過濾，收集溶液，提取液定容，測定提取率。

不同提取時間：取龍牙楤木葉粉樣品5份，每份樣品0.333g，放入試管中，加入70%的乙醇10mL，在70℃水浴條件下提取 20、30、40、50、60 min，離心，過濾，收集溶液，提取液定容，測定提取率。

2.6 響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取工藝

參考文獻方法[14-15]，以乙醇濃度（A，%）、提取溫度（B，℃）、提取時間（C，min）3個單因素為自變量，龍牙楤木總黃酮提取率Y（%）為響應(yīng)值設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析試驗。此因素水平編碼表見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平及編碼水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

2.7 龍牙楤木總黃酮對DPPH自由基清除力測定

0.1 mmol/L DPPH自由基以無水乙醇溶解配制。以抗壞血酸作對照。吸取1.0 mL不同濃度待測樣品于試管中，加入3.0 mL DPPH反應(yīng)液，加入4 mL無水乙醇，混勻，避光反應(yīng)30 min，在波長為517 nm處測吸光值，以無水乙醇做空白，測定空白樣吸光值。龍牙楤木總黃酮對DPPH自由基清除率按下式計算：

式中：A0為空白樣品與反應(yīng)液反應(yīng)后的A517nm值；Ai為不同濃度待測樣品與反應(yīng)液反應(yīng)后的A517nm值。

2.8 數(shù)據(jù)處理方法

試驗均進行3次重復，結(jié)果表示為3次結(jié)果平均值，試驗數(shù)據(jù)處理運用Origin 2016、Design-Expert 8.0.6軟件。

3 結(jié)果與分析

3.1 龍牙楤木總黃酮提取單因素試驗結(jié)果分析

龍牙楤木總黃酮提取單因素試驗結(jié)果分析見圖1。

圖1 乙醇體積分數(shù)、提取溫度、料液比、提取時間對黃酮得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration，extraction temperature，liquid to solid ratio and extraction time on extraction yield of flavonoids

總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增大先上升后下降，70%時提取率達到最大（圖1a）。根據(jù)“相似相溶”原理，不同濃度乙醇對物質(zhì)有不同的溶解力。當乙醇濃度較低時，提取液中的水含量高，使得水溶性的糖類物質(zhì)析出較多；當乙醇濃度較高時，龍牙楤木中醇溶性物質(zhì)溶出量增大[13]，單位體積提取劑給予龍牙楤木總黃酮的空間減小，導致提取率降低。綜合考慮原料和試劑消耗等因素，選取乙醇濃度為60%、70%、80%3個水平進行響應(yīng)面試驗。

提取溫度對于龍牙楤木總黃酮提取率有一定影響，總黃酮提取率隨溫度的升高而升高，70℃時最大，后開始呈下降趨勢（圖1b）。分析可能是由于適當升溫有利于黃酮類物質(zhì)的溶出、擴散[16]；但當溫度過高時，一方面乙醇提取劑開始揮發(fā)，導致提取劑濃度降低，另一方面溫度過高會造成黃酮類物質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，致使黃酮提取率降低。綜合考慮原料和能源消耗等因素，選取溫度為60、70、80℃3個水平進行響應(yīng)面試驗。

在不同料液比條件下，龍牙楤木總黃酮提取率隨料液比呈先增加后降低（圖1c）。當料液比為1∶30（g/mL），龍牙楤木總黃酮提取率最高；當料液比超過1∶30（g/mL）時，總黃酮提取率開始降低，分析可能原因是由于單位體積提取劑內(nèi)黃酮含量降低，被分散的黃酮容易發(fā)生變性分解。綜合考慮原料和試劑消耗等因素，選定料液比1∶30（g/mL）進行后續(xù)試驗。

龍牙楤木黃酮提取率隨著提取時間的增加而增加，在30 min提取率達到最高后開始降低（圖1d）。延長提取時間使得黃酮充分溶出，提取率升高，但提取時間繼續(xù)增加，由于黃酮含量為一定值，大部分黃酮已基本溶出后，黃酮含量不再升高[14-16]；若提取時間過長，容易造成黃酮的緩慢分解。綜合原料消耗和時長等因素，選取提取時間20、30、40 min 3個水平進行響應(yīng)面試驗。

3.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化龍牙楤木總黃酮提取工藝

Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗的結(jié)果如表2。

表2 龍牙楤木總黃酮提取Box-Behnken試驗方案與結(jié)果Table 2 Extraction of Box-Behnken test scheme and result of Aralia elata

利用Box-Behnken選項對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得龍牙楤木總黃酮提取率Y（%）對乙醇濃度 A（%）、提取溫度 B（℃）和提取時間 C（min）的二次多項回歸方程：

Y=2.20-0.024A-0.081B-0.01C-0.065AB-0.098AC-0.097BC-0.44A2-0.34B2-0.38C2

影響龍牙楤木總黃酮提取率因素的顯著順序為：B>A>C（提取溫度>乙醇濃度>提取時間）。對二次回歸方程進行方差分析的結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

續(xù)表3 回歸模型方差分析表Continue table 3 Analysis of variance of regression model

結(jié)果表明，該回歸模型極顯著（P<0.01），失擬項P=0.125 1，不顯著，決定系數(shù)R2=0.997 6；此數(shù)據(jù)表明模型與數(shù)據(jù)擬合程度較高，對于優(yōu)化提取龍牙楤木總黃酮是一較為合理準確的預(yù)測模型。

乙醇濃度（A），提取溫度（B），提取時間（C）3個交互因子之間的交互作用對龍牙楤木總黃酮提取率的影響可由觀察響應(yīng)曲面的變化情況和等高線的疏密程度而知。如圖2，響應(yīng)曲面圖呈良好的傘狀，等高線呈橢圓形且分布緊密，表示兩因素交互作用顯著[17-18]；黃酮提取率由四周邊緣向內(nèi)逐漸增大，在中心位置時提取率最大。

圖2 乙醇濃度、提取溫度、提取時間對黃酮得率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 The contour and response surface of ethanol concentration，extraction temperature and extraction time influenced the yield of flavonoids

通過分析，龍牙楤木總黃酮的最佳提取條件是：乙醇濃度69.8%，提取溫度68.8℃，提取時間30.0 min，總黃酮提取率的理論值為2.21%。在此最佳工藝參數(shù)下進行驗證試驗，平行3次，3次結(jié)果的總黃酮提取率平均值為2.20%，與預(yù)測值基本一致，相對誤差為0.45%，說明此模型適用于模擬優(yōu)化龍牙楤木總黃酮提取率。

3.3 龍牙楤木總黃酮抗氧化活性

龍牙楤木總黃酮對DPPH自由基的清除作用見圖3。

圖3 龍牙楤木總黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activity to DPPH·of flavonoids from Araliaelata

隨著濃度增加，抗壞血酸作對照，龍牙楤木總黃酮對DPPH自由基的清除率呈上升趨勢。DPPH自由基清除力是抗氧化活性的重要指標[19-20]，因此龍牙楤木總黃酮對DPPH自由基具有良好的清除能力，即具有一定的抗氧化活性。

4 結(jié)論

通過單因素試驗分析選出乙醇濃度、提取溫度、提取時間的三因素三水平取值，利用Box-Bohnken Design原理設(shè)計試驗。結(jié)果表明，3個提取因素對總黃酮提取率影響的顯著順序依次為：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間。

通過響應(yīng)面分析優(yōu)化所得最佳提取參數(shù)為：乙醇濃度69.8%，提取溫度68.8℃，提取時間30 min，該條件下理論總黃酮提取率為2.21%。驗證試驗測得總黃酮提取率為2.20%，相對誤差為0.45%，說明此優(yōu)化參數(shù)較為合理正確。