樹莓酒主發(fā)酵期活性成分含量變化及降血脂作用研究

姜燕，于潤美，李惠津，張海悅，翟碩

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000；2.長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院藥理所，吉林長春130012）

樹莓又稱“覆盆子”，薔薇科懸鉤子屬漿果植物，其性微溫，味甘酸，腎經(jīng)、歸肝，具有補肝益腎、明目之功效[1]。樹莓中除了含有豐富的糖、有機(jī)酸、維生素C等營養(yǎng)成分，還有黃酮類、樹莓酮、多酚類等活性成分具有抗氧化、降血脂能力[2]。樹莓果實和葉片中含有黃酮類物質(zhì)，不僅具有活血化瘀、降血糖、提高免疫功能，而且對細(xì)胞損傷具有一定的修復(fù)作用。孫金旭等[3]測得樹莓總黃酮含量為0.312 mg/mL?？傸S酮能明顯延長小鼠凝血時間，縮短二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集肺栓塞所引起呼吸喘促持續(xù)的時間；可降低高膽固醇血癥動物血清總膽固醇和甘油三酯含量。樹莓中樹莓酮的含量約為0.014 g/L～0.034 g/L，具有很好的分解轉(zhuǎn)化脂肪的功能。Aspeea[4]等通過高效液相-質(zhì)譜方法確定了樹莓中36種酚類物質(zhì)包括黃酮苷和單寧的含量，且類黃酮含量較高。

研究樹莓酒主發(fā)酵期總酚、總黃酮和樹莓酮含量的變化以及樹莓酒的輔助降血脂作用。樹莓發(fā)酵制備樹莓酒，不僅解決了樹莓鮮果不易貯存的問題，改善了鮮果過酸的口感，并且對預(yù)防高脂血癥和心腦血管疾病具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“紅寶玉”樹莓：吉林省白山市玖宏樹莓種植基地；安琪葡萄酒果酒專用酵母：湖北省宜昌市安琪酵母有限公司；樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)品（99.99%）：南通興成生物制品廠；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%）：天津市化學(xué)試劑一廠；福林酚：生工生物工程股份有限公司；甲醇、乙醚、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%）、碳酸氫鈉、硫酸鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氯化鋁、濃鹽酸、碳酸鈉（分析純）：北京化工廠；高脂飼料（其中包含77.5%基礎(chǔ)飼料、2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.2%膽酸鈉、0.3%丙硫氧嘧啶）：北京華阜康生物科技股份有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒：南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物

SD 大鼠，體重180 g～200 g，雄性。合格證號：SCXK（遼）2015-0001，遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；7080全自動生化分析儀：日本日立公司；DL5M離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；M34510解剖器械：天津眾美科技開發(fā)有限公司；LC-10AT/SeriesⅢ高效液相色譜儀：日本島津蘇州公司/美國科學(xué)系統(tǒng)公司；Varian Cary 50紫外可見分光光度計：上海馭锘實業(yè)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 樹莓酒制備工藝流程

樹莓→原料分級→清洗→打漿→糖酸調(diào)節(jié)→接種果酒酵母→發(fā)酵→陳釀→澄清→二次調(diào)配→罐裝→殺菌→產(chǎn)品

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在765nm處測定不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值[5]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并以此計算樹莓酒總酚含量。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在510 nm處測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值[6]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并以此計算樹莓酒總黃酮含量。

樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解定容，混勻，配制成500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，4℃保存。將樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)液稀釋配制成濃度為 3.20、4.20、6.40、32.00、64.00 μg/mL系列樣品，以樹莓酮峰面積比值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，以樹莓酮的質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 樹莓酮提取及分析方法

主發(fā)酵期每天取10 mL樹莓酒于100 mL濃度為99.9%的甲醇溶液中，60℃條件下水浴2 h，過濾后蒸干，用乙醚溶解后，用1%鹽酸提取，所得酸水液經(jīng)堿化后再用乙醚萃取，除去樹莓提取物中堿性成分。將分出堿性成分的乙醚液，再分別用5%NaHCO3和2%NaOH萃取，所得水溶液分別酸化后用乙醚萃取，除去提取物中的弱酸性成分和酚性成分。將分出堿性、酸性、酚性成分的樹莓提取物乙醚液用水洗至中性，以無水Na2SO4干燥后，加NaHCO3飽和溶液，分出水層，加堿液處理，以乙醚萃取，得到乙醚萃取液，自然揮發(fā)掉溶劑，甲醇定容至5 mL，過0.45 μm的微孔濾膜，密封 4 ℃冷藏，備用[7]。

樹莓酮采用高效液相色譜分析。色譜條件：Symmetry C18色譜柱（2.0 mm×50 mm，2 μm）。流動相A為水，B 為甲醇；0～5 min等度洗脫：45%A：55%B。流速為 0.5 μL/min，柱溫 35 ℃，進(jìn)樣體積 10 μL。

1.4.4 動物造模、分組及給藥

樹莓酒的降血脂實驗按照國家食藥監(jiān)局《輔助降血脂功能評價方法》[8]中的混合型高脂血癥檢驗方法進(jìn)行。健康成年雄性大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，按體重隨機(jī)分成2組，10只大鼠給予基礎(chǔ)飼料作為空白對照組，50只給予高脂飼料作為模型對照組，每周稱量體重1次。模型對照組給予高脂飼料2周后，空白對照組和模型對照組大鼠不禁食不禁水，取尾靜脈血，采血后盡快分離血清，測定血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。根據(jù)血脂水平將模型對照組隨機(jī)分成4組，分別為模型組、樹莓酒0.76 g/kg劑量組、樹莓酒0.38 g/kg劑量組、樹莓酒0.19 g/kg劑量組。樹莓酒各劑量組每日灌胃一次，按10 mL/kg體積灌胃給藥，連續(xù)給藥35 d，灌胃期間各組自由進(jìn)食和飲水，空白對照組和模型組給予同體積蒸餾水，每周稱量一次體重，實驗結(jié)束時禁食16 h不禁水。測定指標(biāo)包括：

1）體質(zhì)量增加量：分別記錄大鼠體重量，計算體重增加速度。

2）分別采用試劑盒測定血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C指標(biāo)。

1.4.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)處理。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間每兩個均數(shù)的比較采用Q檢驗，p＜0.05說明差異有顯著性。

2 樹莓酒主發(fā)酵期活性成分含量的變化

2.1 樹莓酒主發(fā)酵期總酚含量的變化

酚類物質(zhì)具有抗氧化和降血脂血糖等作用，并賦予果酒醇厚、豐滿、結(jié)構(gòu)感強(qiáng)，后味悠長的特點，提高酒的耐儲存能力。果酒的多酚類物質(zhì)主要有白藜蘆醇和沒食子酸等[9]。通過沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）及回歸方程測得樹莓酒主發(fā)酵期總酚含量的變化如圖2所示。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

在主發(fā)酵階段（第0～8天），隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在酵母菌的作用下使果實中的總酚進(jìn)一步浸出，樹莓酒中總酚含量逐漸增加，在第6天以后增加速度緩慢，從發(fā)酵初期的2.230 g/L提高到2.330 g/L。

圖2 樹莓酒主發(fā)酵期總酚的變化Fig.2 Total phenol content of raspberry wine during primary fermentation period

2.2 樹莓酒主發(fā)酵期總黃酮含量的變化

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Putin standard curve

擬合的回歸方程為y=0.001 1x+0.001 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 5。在酵母菌發(fā)酵樹莓酒的過程中，黃酮含量的變化趨勢如圖4所示。

圖4 樹莓酒主發(fā)酵期總黃酮的變化Fig.4 Total flavonoid content of raspberry wine during primary fermentation period

在發(fā)酵初期黃酮含量增加較快，與發(fā)酵過程中酒精含量的增加趨勢基本吻合，這是由于酒精有利于黃酮的提取，發(fā)酵后期黃酮含量增加速度緩慢，最后基本保持不變?？傸S酮含量從0.164 g/L提高到0.298 g/L。

2.3 樹莓酒主發(fā)酵期樹莓酮含量的變化

樹莓酮屬于芳香類酚類化合物，可以很好的分解轉(zhuǎn)化脂肪，結(jié)構(gòu)與具有減肥和改變脂質(zhì)代謝辣椒素相似，被稱為“天然脂肪轉(zhuǎn)化因子”[6-9]。樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。

圖5 樹莓酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Raspberry ketone standard curve

擬合的回歸方程為y=14.301x-15.13，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。樹莓酒主發(fā)酵期樹莓酮含量的變化見圖6。

如圖6所示，在發(fā)酵過程中，樹莓酮含量持續(xù)增加，在第5天以后上升緩慢，主發(fā)酵結(jié)束后其含量從2.300 μg/mL提高到9.456 μg/mL，這是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行酒精度增加，利于樹莓酮浸提，當(dāng)酒精度變化緩慢時，樹莓酮變化也趨于穩(wěn)定。

圖6 樹莓酒主發(fā)酵期樹莓酮含量的變化Fig.6 Raspberry ketone content of raspberry wine during primary fermentation period

3 樹莓酒成品

樹莓酒主發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)降酸和澄清等工序[10-11]，得到樹莓酒成品。依據(jù)GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]進(jìn)行感官和理化指標(biāo)、衛(wèi)生檢測。成品樹莓酒外觀性狀呈酒紅色、透明澄清、無雜質(zhì)沉淀，具有樹莓特有的香味，各項指標(biāo)均符合國家規(guī)定的果酒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4 樹莓酒輔助降血脂功效

4.1 樹莓酒對小鼠體重的影響

不同劑量酒樣對大鼠體重的影響見表1。

表1 不同劑量酒樣對大鼠體重的影響Table 1 Effects of different doses of raspberry wine on the rats weight

由表1可知，各組大鼠在實驗前的初體重以及前3周體重均無明顯差異（p＞0.05）。實驗第四周以后，高劑量組與模型組相比差異顯著（p＜0.05），高劑量組大鼠體重增長緩慢，可能是因為樹莓酮通過調(diào)解糖脂的代謝紊亂、改善瘦素抵抗和胰島素抵抗等綜合作用來降低肥胖大鼠的體重[13-16]。高脂、高熱量飼料會造成動物肥胖，而高劑量樹莓酒可以緩解因為高熱量造成的體重增長。

4.2 樹莓酒對大鼠血脂水平的影響

給予高脂飼料14 d不同劑量酒樣對大鼠血脂水平的影響如表2所示。

模型組、樹莓酒各劑量組的TC水平、TG含量，與空白對照組比較都有顯著性（p＞0.05）。模型組、樹莓酒各劑量組LDL-C含量都升高，與空白對照組比較都有極顯著性（p＜0.01），模型組、樹莓酒各劑量組HDL-C含量，與空白對照組比較無顯著性（p＞0.05）。綜合判定混合型高脂血癥動物模型造模成功。不同劑量酒樣對大鼠血脂水平的影響見表3。

由表3可見，樹莓酒0.76 g/kg劑量組對TG、TC、LDL-C含量與模型組比較有顯著性（p<0.05），模型組和樹莓酒各劑量組對HDL-C的影響并不顯著（p＞0.05），且各組之間的變化差異也不明顯。樹莓中含有大量的花青素，研究發(fā)現(xiàn)花青素可以使miR-33a和miR-122的表達(dá)正?；?，miR-33和miR-122可以反饋抑制調(diào)節(jié)miR-33a的靶基因ABCA1的水平和miR-122的靶基因FAS和PPAR/δ的表達(dá)，從而減少肥胖大鼠肝臟膽固醇含量和減少脂肪酸合成[17-20]。樹莓酮通過抑制參與脂肪的生成途徑，包括過氧化物酶體增殖物活化基因受體G（PPARγ）和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBPα）[21-22]，這導(dǎo)致了進(jìn)一步的脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白表達(dá)下調(diào)（AP2）[23-24]，從而抑制脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)?？傊?，樹莓酒0.76 g/kg劑量組與模型組比較，明顯降低高脂血癥大鼠血清中各項指標(biāo)，具有顯著性（p＜0.05）。

表2 給予高脂飼料14 d不同劑量酒樣對大鼠血脂水平的影響Table 2 Effect of 14 days of high fat diet on serum lipid levels in rats

表3 不同劑量酒樣對大鼠血脂水平的影響Table 3 Effect of raspberry wine samples on the lipid levels of hyperlipidemic rats

5 結(jié)論

探究樹莓酒主發(fā)酵期主要活性成分含量的變化及其降血脂活性。在酵母菌的作用下總酚、總黃酮進(jìn)一步浸出，主發(fā)酵結(jié)束時總酚、總黃酮和樹莓酮含量分別達(dá)到 2.330、0.298、9.456 μg/mL。動物實驗表明，樹莓酒中劑量組0.38 g/kg和低劑量組0.19 g/kg與模型組差異不顯著，高劑量組0.76 g/kg與模型組相比差異顯著（p＜0.05），樹莓酒可以有效抑制高脂大鼠的體重，且明顯降低高脂血癥大鼠血清中各項指標(biāo)，說明樹莓酒在一定劑量之內(nèi)具有輔助降血脂功效。