馬齒莧多糖抑制HepG2細胞存活的作用機制

胡慶娟，牛慶川，宋皓，白書瑜，賀文杰，李玉萍

（江西科技師范大學生命科學學院，江西南昌330013）

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為藥食兩用的一年 生草本植物，具有神經(jīng)保護[1-2]、抗菌[3]、抗糖尿病[4-5]、抗氧化[6]、抗炎[7]、抗癌[8-10]等多種功效。研究表明馬齒莧中含有生物堿、黃酮、多糖、多巴胺等多種生物活性成分[11-15]。其中，馬齒莧多糖（polysaccharide of Portulaca oleracea L.，POP-A）是其主要活性成分之一，具有提高免疫力、抗病毒、降糖調(diào)脂、抗癌及抗衰老等生物活性[10，16-23]。

目前對POP抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡已有少量的初步研究。Zhao Rui等[10，18]研究結(jié)果表明POP可抑制宮頸癌細胞的增殖，通過參與調(diào)控TLR4/NF-kB信號通路，觸發(fā)DNA損傷，誘導細胞凋亡；崔旻等[24]研究表明POP可以抑制SMMC7721肝癌細胞，增強細胞免疫；王曉波等[25]研究發(fā)現(xiàn)POP可以抑制BEL-7402肝癌細胞，提高細胞免疫，具有明顯的抑制腫瘤的作用；丁虹等[26]研究結(jié)果表明POP能夠抑制宮頸癌細胞生長，誘導癌細胞凋亡。但對于HepG2肝癌細胞的研究還鮮見報道。

為此，本研究在課題組前期分離提取馬齒莧多糖的基礎上，以HepG2肝癌細胞為研究對象，采用體外培養(yǎng)法和四甲基偶氮唑鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]法檢測了POP-A對HepG2肝癌細胞的抑制作用，同時采用熒光定性定量法、免疫印跡法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-PCR，RT-PCR）法探討了POP-A抑制HepG2肝癌細胞的作用機制，為POP-A抗腫瘤活性的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬齒莧多糖POP-A按照江西科技師范大學生命科學學院實驗室之前的優(yōu)化條件獲取[27]。

改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、焦碳酸二乙酯水（diethylpyrocarbonate，DEPC）：美國Gibco公司；胎牛血清（fatal bovine serun，F(xiàn)BS）：杭州四季青生物工程有限公司；青鏈霉素雙抗（100×）、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（1×）、四甲基偶氮唑鹽（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒、Fluo-3 AM鈣離子熒光探針、Beyozol試劑、ECL發(fā)光試劑盒、Western及IP細胞裂解液、山羊抗兔lgG（H+L）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、山羊抗小鼠 lgG（H+L）、抗體（p53、Bax）：碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國 Ameresco公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸、Tris-Hcl-tween緩沖液（Tris buffered saline tween，TBST）：北京索萊寶生物科技公司；AII-in-One First-StrandcDNA試劑盒、Synthesis SuperMixfor qPCR：北京全式金生物技術(shù)有限公司；Protein Ladder：美國Ladder Thermo公司；蛋白變性5×SDS-PAGE上樣緩沖液：康為世紀公司；所用化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

Hank’s 液：0.14 g CaCl2，0.4 g KCl，0.06 g KH2PO4，0.10 g MgSO4·7H2O，8.0 g NaCl，0.35 g NaHCO3，0.12 g Na2HPO4·12H2O，1.0 g D-葡萄糖，0.01 g Phenol red（酚紅），10 mL FBS，溶于1 000 mL新鮮超純水中，0.22 mm過濾，4℃保存。

細胞培養(yǎng)板：美國Corning公司；水機相微孔濾膜：美國Millipore公司。

1.2 儀器與設備

HV-85型高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；IX-71型倒置光學顯微鏡：日本Olympus公司；Thermo Forma Series-Ⅱ型CO2培養(yǎng)箱、Multiscan MK3型全自動酶標儀、Forma class-II/A2生物安全柜：美國Thermo公司；JJ500精密電子天平：美國雙杰兄弟公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；PHS-29A數(shù)顯酸度計：上海虹益儀器有限公司；5804R型離心機：德國Eppendorf公司；F-2700熒光分光光度計：日本Corporation公司；Vortex-Genie 2漩渦振蕩器：美國Scientific公司；SZCL-4型數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限公司；THZ-82A型水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市榮華儀器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 HepG2肝癌細胞的培養(yǎng)

HepG2細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)液（10%FBS，37℃）中，當細胞生長到培養(yǎng)瓶底部的80%左右時進行傳代培養(yǎng)或以下試驗研究。

1.3.2 MTT法檢測POP-A對HepG2肝癌細胞存活率的影響

將HepG2細胞以1×105個/mL的濃度種到96孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的POP-A處理細胞24 h或48 h，之后更換新鮮DMEM培養(yǎng)基，避光加入20 mL 5 mg/mL的MTT，37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，除去全部孔的上清，將150 mL的DMSO依次加入每孔，用錫箔紙包裹培養(yǎng)板后，放于搖床上搖動10 min，在波長為492 nm處，使用酶標儀檢測吸光度，計算并分析各組的細胞存活率，公式如下：

1.3.3 POP-A對HepG2肝癌細胞線粒體膜電位的影響

將HepG2細胞懸液以1×105個/mL的濃度種到6孔培養(yǎng)板中，37℃過夜培養(yǎng)后，分別加入1.25、2.5、5 mg/mL 3個濃度的 POP-A，再孵育24 h（37℃），吸棄上清，加PBS輕洗兩次，并將殘余的PBS吸凈。隨后加入含5 mg/mLJC-1工作液的培養(yǎng)基，37℃孵育60 min，吸棄上清，用PBS溶液洗滌細胞兩次。每孔加入2 mL的DMEM培養(yǎng)液，37℃孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察。

陽性對照組設置：取1 mL碳酰氰基-3-氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone ，CCCP）（10 mmol/L）加入到1 mL新鮮培養(yǎng)基中，使得終濃度為10 mmol/L。將含10 mmol/L CCCP的培養(yǎng)基加入到6孔培養(yǎng)板中，放于培養(yǎng)箱中孵育20 min。孵育完成，吸棄上清，用JC-1染色緩沖液洗滌細胞兩次。每孔加入2 mL的DMEM培養(yǎng)液，37℃孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.3.4 POP-A對HepG2肝癌細胞內(nèi)鈣離子的影響

將HepG2細胞懸液以1×105個/mL的濃度種到6孔板中，每孔2 mL。37℃培養(yǎng)過夜后，每孔分別加入1.25、2.5、5 mg/mL 3個濃度的 POP-A，再孵育 24 h（37℃）。吸棄上清，加PBS輕洗兩次，并將殘余的PBS吸凈。加入含4 mmol/L的Fluo-3 AM的培養(yǎng)基（不含血清），37℃孵育20 min。之后每孔加5倍體積的Hank’s（含 1%FBS）再培養(yǎng) 40 min，裝載完成之后，吸棄上清，4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液洗3次，在熒光顯微鏡下觀察。之后用4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液重懸細胞，用激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為526 nm的熒光分光光度計，檢測細胞內(nèi)鈣離子的濃度。

1.3.5 POP-A對HepG2肝癌細胞中p53和Bax蛋白表達的影響

將6孔板放置于冰上，加PBS輕洗2次。取出蛋白裂解液，將苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）與裂解液按 1∶100比例（體積比）混合，每孔加入1 mL裂解液，充分吹打至細胞完全脫落，之后移置離心管中，4℃離心（12 000 r/min，10 min），取上清，即為不同組別的細胞蛋白質(zhì)樣品，-20℃保存?zhèn)溆?。制?0%分離膠和5%濃縮膠，取等量蛋白上樣，電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，取出聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，封閉 2 h，一抗孵育（一抗的稀釋根據(jù)具體的說明書），4℃過夜。用TBST緩沖液洗去膜上殘余一抗。二抗孵育（二抗的稀釋和種類根據(jù)具體的說明書），室溫平搖1 h后，用TBST緩沖液洗去膜上殘余二抗；ECL檢測、曝光、顯影、定影[28]。

1.3.6 POP-A對HepG2肝癌細胞中p53和Bax基因表達的影響

取出6孔培養(yǎng)板，吸棄上清，PBS洗滌3次，每孔加入1 mL Beyozol，晃動3～5下，之后加入裂解液，充分吹打至細胞完全脫落，移置1.5mL的離心管里，靜置5 min，充分裂解樣品。加0.2 mL氯仿，渦輪混合15 s，靜置3 min，4℃離心（12 000 r/min，15 min），取上層，加0.5 mL異丙醇，晃動混勻，靜置10 min，4℃離心（12 000 r/min，10 min），吸棄上清，即得到RNA白色沉淀。加1mL75%乙醇（DEPC水配制），劇烈渦旋至沉淀完全脫離管壁，充分洗滌沉淀。4℃離心（7 500 r/min，5 min）。棄上清，用小型離心機（轉(zhuǎn)速＜5 000 r/min）離心1 s，吸棄上清。待RNA略干后，加入RNA溶解液溶解，分裝到200mL離心管中，-80℃保存?zhèn)溆?。? mL RNA樣品于微量分光光度計測定。以OD260/280表示RNA的純度，測定值在1.8～2.0范圍內(nèi)，則可用于后續(xù)試驗。

按順序 5×TranscriptTM All-in-One SuperMix forq PCR（4 mL），RNase-free 水（15 mL），總 RNA/mRNA（1 mL）加入PCR管中，使總RNA充分接觸混合液。輕輕混勻后，將PCR反應體系放于PCR儀內(nèi)，按照42℃（10 min），42℃（5 s），4℃結(jié)束，進行逆轉(zhuǎn)錄反應，合成cDNA，將合成的cDNA存放于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR所用引物序列見表1，反應體系見表2，反應條件見表3。

表1 實時熒光定量PCR的引物序列表Table 1 Table of the primer sequence in RT-PCR

表2 實時熒光定量PCR的反應體系Table 2 Reaction system of RT-PCR

續(xù)表2 實時熒光定量PCR的反應體系Continue table 2 Reaction system of RT-PCR

表3 實時熒光定量PCR的反應條件Table 3 Reaction condition of RT-PCR

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗結(jié)果以表示，計量資料用方差分析法分析，用t檢驗統(tǒng)計處理。P＜0.05被認為兩變量之間有統(tǒng)計學顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 POP-A對HepG2肝癌細胞存活的抑制作用

POP-A對HepG2肝癌細胞存活率的影響見圖1。

圖1POP-A對HepG2肝癌細胞存活率的影響Fig.1 Effects of POP-A on the viability of HepG2 cells

由圖1可知，與對照組相比，POP-A處理HepG2肝癌細胞24 h和48 h之后，顯著的降低HepG2肝癌細胞的存活率，且隨著POP-A濃度及處理時間（分別為24 h和48 h）的增加，HepG2肝癌細胞的存活率逐漸降低。當POP-A濃度為1.25、2.5、5 mg/mL時，可明顯的降低細胞的存活率，因此，選用1.25、2.5、5 mg/mL的POP-A用于后續(xù)試驗。

2.2 POP-A對HepG2肝癌細胞線粒體膜電位的影響

POP-A對HepG2肝癌細胞線粒體膜電位的影響見圖2。

圖2POP-A對HepG2肝癌細胞的線粒體膜電位的影響Fig.2 Effects of POP-A on mitochondrial membrane potential of HepG2 cells

線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個特點[29]。JC-1線粒體熒光探針常被用于線粒體膜電位的檢測，A（JC-1多聚體狀態(tài)）代表線粒體膜電位升高，細胞處于正常狀態(tài)；B（JC-1單體狀態(tài)）代表線粒體膜電位下降，細胞處于凋亡早期。從圖2可知，與對照組相比，用POP-A處理的HepG2肝癌細胞，紅色熒光的細胞比例降低，綠色熒光的細胞比例增加，表明POP-A降低了細胞的線粒體膜電位，誘導了細胞的早期凋亡。

2.3 POP-A對HepG2肝癌細胞內(nèi)鈣離子的影響

POP-A對HepG2肝癌細胞內(nèi)鈣離子的影響見圖3。

圖3 POP-A對HepG2肝癌細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響Fig.3 Effects of POP-A on Ca2+concentration on HepG2 cells

由圖3A可知，與對照組相比，POP-A組中的鈣離子熒光強度增強。同時由圖3B的統(tǒng)計結(jié)果可知，與對照組相比POP-A組中的鈣離子濃度明顯升高，表明POP可促進HepG2肝癌細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。

2.4 POP-A對HepG2肝癌細胞中p53和Bax蛋白表達的影響

POP-A對HepG2肝癌細胞中p53蛋白表達的影響見圖4

圖4POP-A對HepG2肝癌細胞p53蛋白水平表達的影響Fig.4 Effects of POP-A on the expression of p53 protein in HepG2 cells

由圖4分析結(jié)果可知，與對照組相比，HepG2肝癌細胞經(jīng)POP-A處理后，p53蛋白表達顯著升高，且p53蛋白表達量隨POP-A濃度的增大而逐漸升高。

POP-A對HepG2肝癌細胞中Bax蛋白表達的影響見圖5。

圖5 馬齒莧多糖POP-A對HepG2肝癌細胞Bax蛋白水平表達的影響Fig.5 Effects of POP-A on expression of Bax protein in HepG2 cells

由圖5結(jié)果可知，與對照組相比，HepG2肝癌細胞經(jīng)POP-A處理后，Bax蛋白表達顯著升高，且Bax蛋白表達量隨POP-A濃度的增大而逐漸升高。

2.5 POP-A對HepG2肝癌細胞中p53和Bax基因表達的影響

POP-A對HepG2肝癌細胞中p53基因表達的影響見圖6

圖6POP-A對HepG2肝癌細胞p53基因表達的影響Fig.6 Effects of POP-A on expression of p53 gene in HepG2 cells

由圖6結(jié)果可知，與對照組相比，HepG2肝癌細胞經(jīng)POP-A處理后，p53基因相對表達量顯著增加，且呈一定的濃度依賴性。

POP-A對HepG2肝癌細胞中Bax基因表達的影響見圖7。

由圖7結(jié)果可知，與對照組相比，HepG2肝癌細胞經(jīng)POP-A處理后，Bax基因相對表達量顯著增加，且基因相對表達量隨POP-A濃度的增大而逐漸增加。

圖7POP-A對HepG2肝癌細胞Bax基因表達的影響Fig.7 Effects of POP-A on expression of Bax gene in HepG2 cells

3 結(jié)論

采用MTT法結(jié)果顯示，與對照組相比，用POP-A分別處理HepG2肝癌細胞24 h和48 h后，均能顯著降低HepG2肝癌細胞的存活率，且呈一定的濃度依賴性。從結(jié)果中可知在POP-A濃度為1.25、2.5、5 mg/mL時，作用效果最為顯著。

細胞凋亡是細胞死亡的方式之一，是細胞受到外界刺激時，對刺激所作出反應的一種主動性的死亡方式。研究表明，腫瘤細胞的死亡多是通過凋亡引起的，凋亡對于抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有重要的作用，很多抗腫瘤藥物也是通過引起細胞的凋亡來達到抗腫瘤的目的的[30-31]。細胞早期凋亡的重要特征之一是線粒體膜電位降低。當線粒體膜電位降低時，線粒體功能喪失，引起細胞內(nèi)鈣離子濃度增加，細胞發(fā)生凋亡[29]。本試驗采用熒光定性及定量的方法檢測了POP-A對HepG2肝癌細胞線粒體膜電位及細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，POP-A降低了HepG2肝癌細胞線粒體膜電位，提高了細胞內(nèi)鈣離子濃度。表明POP-A可通過降低HepG2肝癌細胞線粒體膜電位，增加細胞內(nèi)鈣離子濃度，導致細胞內(nèi)環(huán)境紊亂，對HepG2肝癌細胞起到抑制作用，初步推斷POP-A抑制HepG2肝癌細胞的作用機制與促進HepG2細胞凋亡有關(guān)。

p53基因是研究較為廣泛的一種抑癌基因，與細胞的增殖、死亡以及腫瘤的產(chǎn)生具有密切的關(guān)系。研究表明，p53基因上調(diào)，可進一步上調(diào)下游的促凋亡基因Bax的表達，促進腫瘤細胞的凋亡，進而導致細胞死亡，抑制腫瘤的產(chǎn)生[30]。本試驗中蛋白印跡和RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，POP-A顯著提高了HepG2肝癌細胞中p53及Bax基因和蛋白的相對表達量，且呈一定的濃度依賴性，推測POP-A通過激活p53下游信號通路對HepG2肝癌細胞起到抑制作用，引起HepG2肝癌細胞的凋亡，導致細胞死亡。

綜上可知，POP-A抑制HepG2肝癌細胞的作用機制與促進HepG2細胞凋亡有關(guān)，主要涉及降低線粒體膜電位，增加細胞內(nèi)鈣離子濃度，激活p53下游信號通路等。由于POP-A抑制HepG2肝癌細胞的作用機制復雜且多樣，其具體作用機制仍需進一步的研究。