假腸膜明串珠菌胞外多糖的分離純化及其抗氧化特性研究

葉廣彬，陳源紅，王長麗，曹德民，李根亮

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西百色533000）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）胞外多糖（ex－ opolysaccharide，EPS）是LAB在生長代謝過程中分泌的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、增稠、絮凝及免疫調(diào)節(jié)等多種功能特性，廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)[1-2]。根據(jù)單糖組成不同，LAB EPS可分為同源多糖（homopolysaccharides，HoPS） 和異源多糖 （heteropolysaccharides，HePS）[3]。LAB HoPS根據(jù)糖單元內(nèi)的連接方式和單糖成分不同，分為 4 類：（1）α-D-葡聚糖，單糖組成為葡萄糖，由α-1，6 糖苷鍵連接聚合，同時可能在 α-1，2、α-1，3 或α-1，4 位有分支結(jié)構(gòu)；（2）β-D-葡聚糖，單糖組成為葡萄糖，糖單元以 β-1，2 鍵或 β-1，3 鍵連接；（3）β-D-果聚糖，單糖組成為果糖，以β-2，1鍵連接，可能在β-2，6處有分支結(jié)構(gòu)；（4）其他，例如聚半乳糖，由結(jié)構(gòu)一致的糖單元以不同的糖苷鍵連接聚合而成[4-5]。

能夠產(chǎn)生EPS的LAB很多，大多分離于傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，如奶制品、黃豆醬、馬奶酒、酸菜等。主要包括腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、植物乳桿菌（Lactobacillus.plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lb.acidophilus）、開菲爾乳桿菌（Lb.kefiranofaciens）、鼠李糖乳桿菌（Lb.rhamnosus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、瑞士乳桿菌（Lb.helveticus）和食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）等[6-11]。隨著LAB研究的不斷深入，其作為食品級工業(yè)生產(chǎn)菌，與其他微生物相比安全性高。然而LAB EPS產(chǎn)量低，菌株穩(wěn)定性差，是制約其大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素[12]。此外，由于LAB的種類及來源不同，其產(chǎn)生的EPS的結(jié)構(gòu)和特性均有所差異。為了滿足食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的需要，篩選具有產(chǎn)量高、益生作用強的LAB是目前多糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方向。

本研究從東北酸菜發(fā)酵液中分離得到一株高產(chǎn)EPS的菌株，利用生理生化試驗、形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA序列分析，鑒定其種屬地位。并利用生物化學(xué)手段分離純化EPS，探究其抗氧化性質(zhì)，為該EPS的分離純化奠定基礎(chǔ)，為益生元特性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

酸菜發(fā)酵液：收集自哈爾濱農(nóng)家自制酸菜。細菌基因組DNA提取試劑盒（M2023）、質(zhì)粒小量提取試劑盒（M1603）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（L9014）：TIANGAN股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖 2 g、胰蛋白胨 1 g、牛肉膏1 g，酵母提取物0.5 g，K2HPO40.2 g，無水乙酸鈉0.5 g，檸檬酸銨 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.058 g，MnSO4·H2O 0.025 g吐溫-80 0.1 mL，用于供試菌活化及種子液制備；產(chǎn)糖培養(yǎng)基（MRS-S）：用蔗糖代替MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖。

1.3 儀器設(shè)備

SM20利用體視鏡：長沙市秋龍儀器設(shè)備有限公司；BX43生物顯微鏡：奧林巴斯（深圳）工業(yè)有限公司；UV-2600紫外可見分光光度計：日本島津公司；vario ELⅢ元素分析儀：德國Elementar公司。

1.4 方法

1.4.1 產(chǎn)EPS LAB的分離

取酸菜發(fā)酵液樣品，根據(jù)稀釋倒平板法[2]將稀釋液分別涂布于含CaCO3的MRS平板上，30℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取單個具有典型溶鈣圈菌落接種于30 mL/100 mL MRS-S產(chǎn)糖培養(yǎng)中，30℃，靜置培養(yǎng)36 h，測定EPS含量，篩選得到高EPS LAB。

1.4.2 高產(chǎn)EPS LAB的鑒定

觀察高產(chǎn)EPS菌株的菌落形態(tài)特征和菌體形態(tài)特征。根據(jù)蔡妙英常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[13]分類鑒定及試驗方法測定高產(chǎn)胞外多糖菌株的生理生化特性，包括葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗、過氧化氫酶試驗、氧化酶試驗、明膠液化試驗、脲酶及酯酶試驗、精氨酸水解試驗、淀粉水解試驗以及糖發(fā)酵試驗。

利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取高產(chǎn)胞外多糖菌株基因組DNA，以P1：5'AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'；P2：5'TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3'為引物[14]，按照Du等[2]方法進行16S rDNA部分序列擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂凝膠電泳后，用DNA回收試劑盒回收目的片段并進行測序。

1.4.3 EPS的提取及純化

根據(jù)Du等[15]的方法，取發(fā)酵液 300mL，4℃4000×g離心40 min。上清液中加入3倍體積預(yù)冷的95%乙醇，沉淀過夜，4℃12 000×g離心40 min收集沉淀，用250 mL超純水30℃～40℃溶解多糖沉淀，加入250 mL 10%三氯乙酸，充分攪拌4℃靜置10 h，4℃12 000×g離心40 min，向上清液中加入3倍體積預(yù)冷的95%乙醇，沉淀過夜，4℃12 000×g離心40 min收集多糖沉淀，重溶于超純水中，裝入透析袋（截留分子量14 000 Da）中，4℃透析2 d，每8 h時換一次水。將透析得到的EPS樣品，利用Sephadex G-100凝膠過濾層析進一步純化。上樣后，用流速為1 mL/min的去離子水在室溫下進行洗脫，每5 min收集一管，用苯酚-硫酸法測定糖含量，合并含有糖的試管，冷凍干燥處理24 h得到EPS純品。

將上述得到的純多糖配制成1 mg/mL的多糖溶液，利用紫外可見分光光度計進行波長掃描，掃描范圍為190 nm～350 nm，檢測多糖樣品的純度。

1.4.4 元素組成分析

利用元素分析儀測定純多糖樣品中碳元素、氫元素、氮元素及硫元素含量。根據(jù)樣品量、熱導(dǎo)檢測器信號和標準曲線，計算樣品中的元素含量。

1.4.5 總糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸含量的測定

利用苯酚硫酸法測定總糖含量[16]；利用Bradford蛋白質(zhì)染料結(jié)合法測定蛋白質(zhì)含量[17]；利用硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量[18]。

1.4.6 抗氧化活性測定

1.4.6.1 總還原力測定

取不同濃度的多糖溶液1 mL與2.5 mL鐵氰化鉀溶液、2.5 mL磷酸鹽緩沖液，50℃反應(yīng)20 min，之后加入 2.5 mL三氯乙酸（trichloroethanoic acid，TCA）溶液，4 000×g離心30 min。取2.5 mL上清液與0.5 mL FeCl3溶液、2.5 mL去離子水混勻，反應(yīng)10 min后，測定反應(yīng)體系的OD700nm值。以VC為陽性對照[19]。

1.4.6.2 DPPH·清除能力測定

取不同濃度的多糖溶液2 mL與2 mL DPPH-乙醇溶液混勻，暗反應(yīng)30 min，測定混合液的吸光值OD517nm。以VC為陽性對照[20]。根據(jù)公式1計算樣品的DPPH·清除活性：

式中：A0為以水為對照的吸光值；A1為與DPPH·反應(yīng)后的吸光值；A2為樣品溶液的吸光值，即以水代替DPPH溶液，排除樣品本身吸光度對結(jié)果的影響。

1.4.6.3 羥基自由基（·OH）清除能力測定

1 mL不同濃度多糖溶液與1 mL水楊酸-乙醇溶液、1 mL FeSO4溶液混勻，再加入1 mL H2O2溶液，37℃反應(yīng)40 min后，測定OD510nm值。以VC為陽性對照[21]。根據(jù)公式2計算樣品的羥基自由基清除能力：

式中：A0為以水為對照的吸光值；A1為與·OH反應(yīng)后的吸光值；A2為以水代替H2O2溶液的吸光值。

1.4.6.4 超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力測定

1 mL不同濃度多糖溶液與3 mL Tris-HCl緩沖液混勻，25℃放置20 min，之后加入0.3 mL鄰苯三酚溶液混勻，25℃反應(yīng)5 min后，加入1 mL濃鹽酸，測定OD325nm值。VC為陽性對照[22]。根據(jù)公式3計算樣品的O2-·清除率：

式中：A0為加入鄰苯三酚后的吸光值；A1為終反應(yīng)吸光值；A2為只加入Tris-HCl緩沖液的吸光值。

1.4.6.5 H2O2清除能力測定

0.6 mL H2O2與1 mL不同濃度多糖溶液、2.4 mL磷酸鹽緩沖液混勻，室溫反應(yīng)10 min，測定OD230nm值。以VC為陽性對照[23]。根據(jù)公式4計算樣品的H2O2清除能力：

式中：A0為未加樣品的吸光值，即以磷酸鹽緩沖液代替樣品；A1為加入H2O2溶液后的吸光值；A2為樣品溶液的吸光值。

1.4.6.6 Fe2+螯合能力測定

1 mL不同濃度多糖樣品，與0.05 mL FeCl2溶液混勻。向反應(yīng)體系中加入0.2 mL菲啰嗪溶液，劇烈振蕩，室溫反應(yīng)10 min，加水定容至3 mL。測定體系吸光值OD562nm。選取 EDTA·2Na為對照[24]。按照公式（5）計算樣品的Fe2+螯合能力：

式中：A0為未加樣品的吸光值，即以去離子水代替樣品；A1為加入樣品溶液后，反應(yīng)體系的吸光值；A2為以水代替菲啰嗪溶液，反應(yīng)體系的吸光值，排除樣品吸光度的影響。

1.4.6.7 亞硝基（NO2-）清除能力測定

取不同濃度多糖樣品置于具塞試管中，加入1 mL NaNO2溶液，37℃孵化2 h，加水至5 mL。按標準曲線繪制方法進行測定，根據(jù)標準曲線方程計算NaNO2清除量，并根據(jù)公式（6）計算NO2-清除能力[25]：

式中：A0為未加樣品的吸光度，即以水代替待測樣品；A1為加入樣品溶液后，反應(yīng)體系的吸光值；A2為以水代替NaNO2溶液時，反應(yīng)體系的吸光值，排除樣品吸光度的影響。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每個試驗處理均設(shè)置3個重復(fù)，數(shù)據(jù)以均值±標準差形式表示，統(tǒng)計檢驗的顯著水平設(shè)定為0.05。利用JMP（Version 9.0.2，SAS，Inc）軟件進行方差分析及多重比較，并用Sigmaplot（Version 10.0，Systat Software，Inc）軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)EPS LAB的分離與鑒定

本研究從酸菜發(fā)酵液中共分離得到4株典型LAB，其中 GX-1、GX-2、GX-3 和 GX-4四株菌可以明顯產(chǎn)生EPS且菌株GX-3 EPS含量高于其它3株菌，達到（38.42±2.15）g/L。此外，該菌株產(chǎn)生的 EPS含量顯著高于W.confuse KR780676 EPS（17.2 g/L）[26]和Leu.citreum SK24.002 EPS（2.4 g/L）[27]，具有工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)EPS的潛力。菌株GX-3在MRS培養(yǎng)基上菌落為白色，表面光滑，凸起，不透明，近圓形，邊緣整齊。在MRS-S培養(yǎng)基上菌落較大為乳白色，表面光滑，有光澤，附著黏性液體。該菌株革蘭氏染色陽性，菌體呈串珠狀，無鞭毛，不運動，不產(chǎn)芽孢。生理生化試驗以及部分糖發(fā)酵試驗結(jié)果如表1所示。

表1 菌株GX-3生理生化試驗檢測結(jié)果Table 1 Differential phenotypic characteristics of strain GX-3

由表1可知，菌株GX-3能以葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、甘露醇、麥芽糖、山梨醇、蔗糖、棉子糖、阿拉伯糖為底物進行發(fā)酵，而不能以木糖、鼠李糖為底物進行發(fā)酵；且能夠利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，脲酶及酯酶試驗、明膠液化、精氨酸水解試驗、淀粉水解、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗呈陰性。其結(jié)果與Leu.pseudomesenteroides生理生化特性基本一致。

16S rDNA序列分析表明，菌株GX-3部分序列長為1321 bp，與該序列相似性較高的相關(guān)菌株均為Leuconostoc細菌。菌株GX-3系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 菌株GX-3系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of strain GX-3

由圖1可知，該菌株與Leu.pseudomesenteroides DRP-5基因序列的親緣關(guān)系最近，相似性達到99%。結(jié)合GX-3生物學(xué)特性和生理生化結(jié)果分析，將GX-3鑒定為Leu.pseudomesenteroides，并命名為Leu.pseudomesenteroides GX-3。

2.2 EPS的分離純化

GX-3 EPS經(jīng)除菌體、除蛋白、乙醇分級沉淀等步驟后，經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-100進一步層析，樣品洗脫圖呈現(xiàn)單一對稱峰，表明XG5 EPS為分子量相對均一組分。波長掃描結(jié)果表明，XG5 EPS在19 nm～200 nm之間有最大的特征吸收峰，為碳水化合物的特征吸收。在260 nm和280 nm處無紫外吸收峰，說明無核酸和蛋白質(zhì)污染，純度較高。

2.3 GX-3 EPS化學(xué)組成分析

GX-3 EPS的C、H、N及S元素含量分別為（43.27±0.24）%、（7.87±0.02）%、（2.01±0.11）%和 （0.31±0.07）%?？偺?、蛋白質(zhì)、糖醛酸含量分別為（90.98±1.21）%、（0.52±0.03）%和（5.26±0.11）%。其中糖醛酸含量高于Flammulina velutipes EPS[28]，蛋白質(zhì)含量高于Lb.helveticus MB2-1 EPS-3（0.29%）[29]，低于 Hyriopsis cumingii HCP-3 EPS（9.42%）[19]。

2.4 GX-3 EPS的抗氧化活性

2.4.1 總還原力

具有還原力的化學(xué)物質(zhì)通過提供氫原子來阻斷過氧化物的形成，從而破壞自由基反應(yīng)鏈，最終發(fā)揮抗氧化作用。GX-3 EPS總還原力見圖2。

圖2 GX-3 EPS總還原力Fig.2 GX-3 EPS on reducing power

如圖2所示，GX-3 EPS和VC的總還原力與樣品濃度呈正相關(guān)，GX-3 EPS的總還原力始終低于VC，但顯著高于Pediococcus pentosaceus SR2-2 EPS[23]。

2.4.2 對DPPH·的清除作用

DPPH·是一類較為穩(wěn)定的合成自由基，能夠?qū)⑵淝宄幕瘜W(xué)物質(zhì)具有較強的自由基清除能力。GX-3 EPS對DPPH·的清除作用見圖3。

圖3GX-3 EPS對DPPH·的清除作用Fig.3 The GX-3 EPS on DPPH·clearance ability

如圖3所示，GX-3 EPS的DPPH·清除率都隨著樣品濃度的增加而增大，但始終低于VC的清除能力。GX-3 EPS在5 mg/mL時的清除率最大，為（65.34±3.54）%。張玉龍等研究不同種類ESP對DPPH·的清除能力時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ESP濃度為1.0 mg/mL時，其對DPPH·的清除率為33.53%～41.92%，低于本研究中EPS 對 DPPH·清除率[23]。

2.4.3 對·OH的清除作用

·OH是活性氧中最為危險而且活性最強的自由基，可以通過活體免疫作用產(chǎn)生，自由進入細胞膜，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，尤其是對蛋白質(zhì)造成破壞[30]。GX-3 EPS對·OH的清除作用見圖4。

圖4GX-3 EPS對·OH的清除作用Fig.4 The GX-3 EPS on·OH clearance ability

如圖4所示。隨濃度的增加，GX-3EPS和VC的·OH清除率呈現(xiàn)先升高后趨于平緩的趨勢。當(dāng)質(zhì)量濃度達到5.0 mg/mL時，二者對·OH的清除率分別達到（78.24±3.52）%（EPS）和（95.56±2.14）%（VC）。崔靜等[25]發(fā)現(xiàn)EPS6對·OH具有明顯的清除作用，在質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時，清除率高達91.5%，高于本研究中GX-3 EPS對·OH的清除率。

2.4.4 超氧陰離子（O2-·）自由基清除能力

O2-·是一種有毒性的活性氧，可以與大量生物活性分子發(fā)生反應(yīng)，造成蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等的氧化損傷。Huang等[31]曾報道，O2-·清除能力與分子中存在的能夠促進O-H鍵釋放氫離子的親電子成分有關(guān)，如酮基、醛基等。GX-3 EPS對O2-·的清除作用見圖5。

如圖5所示。，隨著GX-3 EPS和VC濃度的增大，清除率呈現(xiàn)先急速升高后保持平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)濃度大于1 mg/mL時，清除率提高幅度明顯減小，在濃度為5 mg/mL時，GX-3 EPS和VC對 O2-·的清除率達到最大，分別為（95.44±4.21）%和（77.48±2.45）%。戚躍明等[32]等研究EPS對O2-·清除能力發(fā)現(xiàn)，在濃度為10 mg/mL時，O2-·清除率達到47.4%，顯著低于本研究中的EPS清除效率（P＜0.05）。由此可以看出，GX-3 EPS對O2-·具有一定的清除活性，其作為添加劑可以降低機體的損傷程度。

圖5 GX-3 EPS對O2-·的清除作用Fig.5 The GX-3 EPS on O2-·clearance ability

2.4.5 H2O2清除能力

H2O2是細胞衰老的誘導(dǎo)因子之一，能夠通過細胞膜，與細胞中的Fe2+或是O2-·作用生成·OH，緩慢地氧化機體，對機體造成氧化損傷[33]。GX-3 EPS對H2O2的清除作用見圖6。

圖6 GX-3 EPS對H2O2的清除作用Fig.6 The GX-3 EPS on H2O2clearance ability

如圖6所示，GX-3 EPS的H2O2清除能力隨著樣品濃度的增加而增大，當(dāng)樣品濃度為5 mg/mL時，清除率為（82.78±3.76）%，顯著高于紫枝GSP2 EPS的H2O2清除能力（48.12%）[32]。

2.4.6 Fe2+螯合能力

銅、鐵等金屬離子參與機體內(nèi)許多氧化反應(yīng)，導(dǎo)致機體氧化損傷[19]。GX-3 EPS對Fe2+的螯合能力見圖7。

圖7 GX-3 EPS對Fe2+的螯合能力Fig.7 The GX-3 EPS on Fe2+chelating ability

由圖7可知，隨著樣品濃度的升高，F(xiàn)e2+螯合能力呈現(xiàn)先快速上升后保持平穩(wěn)的趨勢，且GX-3 EPS的Fe2+螯合能力低于EDTA-2Na的Fe2+螯合能力差異不顯著（P＜0.05）。GX-3 EPS在濃度為 1 mg/mL 的 Fe2+螯合能力達到（92.37±2.34）%，顯著高于Lb.graminis SR12-1 EPS[23]和 Enterococcus faecium BDU7 EPS[34]。Ker等曾發(fā)現(xiàn)EPS的金屬螯合能力與其分子質(zhì)量有關(guān)，且多糖分子的結(jié)構(gòu)、組成及羥基的數(shù)量和位置也影響了螯合能力，具有螯合能力的多糖必須含有-OH、C=O、-S-、-O-、-COOH、-O-等官能團。因此可以看出，GX-3 EPS可能具有高分子質(zhì)量及高分枝度的結(jié)構(gòu)[35]。

2.4.7 NO2-清除能力

亞硝酸鹽是一種劇毒物質(zhì)，也是一種致癌物，在胃部酸性條件下可轉(zhuǎn)變成的亞硝酸。亞硝酸可與胺類物質(zhì)反應(yīng)，生成具有強致癌作用的亞硝基胺類化合物，誘發(fā)人消化道癌等疾病[36]。GX-3 EPS對NO2-的清除作用見圖8。

圖8 GX-3 EPS對NO2-的清除作用Fig.8 The GX-3 EPS on NO2-clearance ability

由圖8可知，GX-3 EPS具有較高的亞硝酸鹽清除能力，在質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，清除率為（38.34±3.28）%，顯著高于Pediococcus sp.SR2-1 EPS[（9.35±0.63）%）][23]，但與 VC相比，GX-3 EPS 的 NO2-清除能力較低。

3 結(jié)論

本研究篩選得到一株高產(chǎn)EPS的LAB，經(jīng)生理生化試驗、形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)試驗鑒定該菌株為Leu.pseudomesenteroides，并命名為 Leu.pseudomesenteroides GX-3。以該菌株為供試菌株，進行EPS分離純化，得到高純度 EPS，其產(chǎn)量為（38.42±2.15）g/L。此外，GX-3 EPS 具有較高的還原力，對 DPPH·、·OH、O2-·、H2O2、和NO2-均具有良好的抗氧化活性，清除效率隨著濃度的增加而增強，最高分別為（65.34±3.54）%、（78.24±3.52）%、（77.48±2.45）%、（82.78±3.76）%和（38.34±3.28）%。因此，Leu.pseudomesenteroides GX-3發(fā)酵得到的EPS作為天然抗氧化劑具有良好的應(yīng)用和開發(fā)前景。