沙蔥水提液體外抗氧化及α-葡萄糖苷酶與胰脂肪酶抑制作用的研究

王婉愉，李姣，王霄凱，張曉峰，呂全軍

（鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，河南鄭州450001）

沙蔥（Allium mongolicum Regel）屬被子植物門（Angiospermae），百合科（Liliaceae），蔥屬（Allium），學(xué)名“蒙古韭”，主要生長(zhǎng)在內(nèi)蒙古、青海、甘肅、新疆等無(wú)污染的沙漠地區(qū)，是一種極具特色的野生蔬菜[1]。沙蔥口感鮮嫩，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，是草原人們喜愛(ài)的天然佳蔬，享有“大漠野菜”、“草原佳蔬”等美譽(yù)[2]。據(jù)蒙藥典記載：沙蔥具有降血壓、降血脂、開(kāi)胃消食、緩解口膩等功效[3]。近年來(lái)，蔥屬植物作為低毒植物藥，其生理保健功能已得到廣泛關(guān)注，具有預(yù)防心血管疾病、抗氧化、抗腫瘤、改善糖代謝等作用，具有很大的潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值[4]。沙蔥作為草原的重要野生植物，以其獨(dú)特的風(fēng)味、豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、并且綠色無(wú)毒副作用越來(lái)越受到人們的青睞[5]。

目前沙蔥的相關(guān)研究多集中于對(duì)其主要活性成分的提取、分離鑒定和對(duì)動(dòng)物機(jī)能的改善方面，關(guān)于α-葡萄糖苷酶抑制活性和胰脂肪酶抑制活性的研究鮮有報(bào)道。本研究以沙蔥為原料，通過(guò)測(cè)定沙蔥水提液的總黃酮含量、DPPH自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶活性和胰脂肪酶活性的抑制作用，來(lái)探討沙蔥的體外抗氧化以及其在調(diào)節(jié)糖脂代謝方面的潛在功效，以期為沙蔥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮沙蔥：于2017年9月20日購(gòu)于內(nèi)蒙古阿拉善，經(jīng)鄭州大學(xué)藥學(xué)院中藥教研室教授鑒定為百合科植物沙蔥（Allium mongolicum Regel）。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、α-葡萄糖苷酶（酶活力≥10U/mg）、胰脂肪酶（酶活力 30 U/mg～90 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物（N-Hippuryl-His-Leu hydratepowder，HHL）：美國(guó) Sigma 公司；奎諾二甲基丙烯酸酯（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid，Trolox）、Tris-HCL、槲皮素：上海阿拉丁試劑公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-18B冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；10-2BS電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Centrifuge 5418高速離心機(jī)：艾本德中國(guó)有限公司；QL-901渦旋混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Spectra Max M2e多功能微孔板讀數(shù)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沙蔥樣品的處理

沙蔥用純水清洗后瀝干水分，放置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥。取干燥樣品粉碎成粉，過(guò)60目篩，用四氯甲烷[質(zhì)量體積比=1 ∶10（g/mL）]脫脂 24 h，抽濾后置于通風(fēng)處晾干。稱取10 g脫脂干粉，加入100 mL純水，常溫下浸提24 h，抽濾，濾渣重復(fù)上述步驟2次，合并2次提取的濾液，于循環(huán)水式蒸發(fā)儀濃縮至液體剩余20 mL，相當(dāng)于10 g脫脂干粉最終溶解在20 mL的溶劑中，提取液濃度即為500 mg/mL。作為待測(cè)提取液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

吸附過(guò)程從本質(zhì)上說(shuō)是一個(gè)濃縮富集工藝。吸附、脫附是依靠吸附劑的物理和化學(xué)吸附作用，把廢氣中的有機(jī)物吸附下來(lái)，從而達(dá)到凈化廢氣的目的。吸附劑進(jìn)行吸附只是把有機(jī)物吸附下來(lái)，并沒(méi)有把有機(jī)物真正轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，并且吸附到一定程度會(huì)達(dá)到飽和，所以通常必須進(jìn)行脫附再生。脫附的方法有飽和蒸汽脫附溶劑回收法、熱空氣脫附溶劑回收法和催化燃燒熱空氣脫附法。

1.3.2 黃酮含量的測(cè)定

采用改進(jìn)的Dowd[11]方法測(cè)定總黃酮含量（total flavonoid content，TFC），以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 μL待測(cè)提取液，梯度稀釋，加入等量2%AlCl3甲醇溶液，于25℃靜置10 min。于415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。提取液的黃酮含量以槲皮素當(dāng)量（quercetin equivalent，QE）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量，最終的黃酮含量以每克干粉所含的槲皮素當(dāng)量表示（mgQE/gDW）。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定[12]

于96微孔板中加入100 μL不同濃度的待測(cè)提取液，隨后加入100 μL 0.208 mmol/L DPPH甲醇溶液，室溫下避光靜置40 min后于517 nm處測(cè)定吸光度。以不同濃度的Trolox甲醇溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，不同樣品相應(yīng)DPPH自由基清除能力表示為mg Trolox equivalent（TE）/g DW，即 Trolox等價(jià)抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率計(jì)算如（公式1）所示：

式中：Ac為對(duì)照組（100 μL DPPH 溶液+100 μL 甲醇溶液）在517 nm處的吸光度；Ai為100 μL樣品液+100 μL DPPH溶液在517 nm處的吸光度；Aj為100 μL樣品液+100 μL甲醇溶液在517 nm處的吸光度。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定[13]

α-葡萄糖苷酶可以水解PNPG生成對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP），pNP在堿性條件下 405 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收值，利用酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度，從而可以檢測(cè)加入樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。α-葡萄糖苷酶溶液與PNPG底物溶液均由0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=6.8）。根據(jù) α-葡萄糖苷酶活性抑制模型：在96孔板中加入8 μL待測(cè)提取液，梯度稀釋，隨后加入112 μL 0.1 mol/L PBS與 20 μL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃恒溫條件下放置15 min后加入20 μL 2.5 mmol/L PNPG底物溶液，37℃恒溫反應(yīng)15 min。最后加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A樣），每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。同時(shí)設(shè)定相同條件下以磷酸鉀緩沖液替代α-葡萄糖苷酶溶液的樣品空白組（A樣空），不加樣品的陰性對(duì)照（A陰），不加樣品、酶的空白對(duì)照組（A空）。水提液α-葡萄糖苷酶活性的抑制率計(jì)算方法如（公式2）所示。并求出相應(yīng)的IC50值。

1.3.5 胰脂肪酶抑制活性的測(cè)定[14]

胰脂肪酶水解對(duì)硝基苯基月桂酸酯（pNP laurate）產(chǎn)生4-硝基苯酚（4-nitrophenol，PNP），PNP 在水溶液中顯黃色，在405nm處有最大吸收峰。通過(guò)測(cè)定405nm處PNP的量來(lái)評(píng)定樣品的脂肪酶抑制活性。底物溶液與酶溶液的配制：稱取0.08 g對(duì)硝基苯基月桂酸酯，溶于100 mL 5 mmol/L乙酸鈉溶液（pH=5.0，含1%曲拉通x-100），配制成8 g/100 mL的pNP laurate溶液，使用前放入沸水中溶解1 min，放置到室溫；胰脂肪酶用蒸餾水溶解配成 10 mg/mL，4℃，13 000 r/min，離心5 min后取上清液。具體試驗(yàn)操作步驟為：在1.5 mL離心管中加入50 μL待測(cè)提取液，梯度稀釋，隨后加入150 μL 10 mg/mL 胰脂肪酶液與 350 μL 0.1 mol/L Tris-HCL緩沖液（pH=8.2），于 37℃預(yù)熱 10 min，隨后加入450 μL底物溶液開(kāi)始反應(yīng)，于37℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，16 000 r/min離心3 min，取上清液加入96孔板，于405 nm處測(cè)定吸光值（A樣），每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。同時(shí)設(shè)定相同條件下以Tris-HCL緩沖液替代胰脂肪酶溶液的樣品空白組（A樣空），不加樣品的陰性對(duì)照（A陰），不加樣品、酶的空白對(duì)照組（A空）。水提液胰脂肪酶活性的抑制率計(jì)算方法如（公式3）所示。并求出相應(yīng)的IC50值。

1.3.6 觀察指標(biāo)及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

本研究DPPH自由基清除試驗(yàn)與酶活性抑制試驗(yàn)中以IC50值即自由基（酶活性）被清除（抑制）一半時(shí)所需的樣品質(zhì)量濃度為觀察指標(biāo)。計(jì)算方法：以自由基清除率（酶活性抑制率）為縱坐標(biāo)、樣品液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作線性回歸，從回歸曲線的置信限制中讀出概率為0.50的估算濃度即為IC50值。IC50值指清除率（抑制率）達(dá)50%時(shí)所需的樣品質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示（±SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙蔥水提液中的黃酮含量

以槲皮素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Quercetin standard curve for TPC analysis

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.009 9x+0.073 8（R2=0.999），說(shuō)明槲皮素在 0～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系；測(cè)定得到沙蔥水提液中的黃酮含量為4.02 mg QE/g DW。

2.2 沙蔥水提液對(duì)DPPH自由基的清除能力

Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

圖2 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of Trolox

由圖2可見(jiàn)，以Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)DPPH自由基的清除率為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=0.597 1x+22.164（R2=0.999），說(shuō)明 Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～150 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與其對(duì)DPPH自由基的清除率具有良好的線性關(guān)系。測(cè)定得到的沙蔥水提物的Trolox等價(jià)抗氧化能力為51.82 mg Trolox/g。

沙蔥水提液在不同濃度下的DPPH自由基清除活性如表1所示。

沙蔥水提液對(duì)DPPH自由基清除作用的IC50擬合曲線如圖3所示。

圖3 沙蔥水提液的DPPH自由基清除活性Fig.3 Scavenging activity of Allium mongolicum Regel aqueous extract on DPPH radicals

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，根據(jù)自由基的清除情況可評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力，DPPH·乙醇溶液呈特征性的紫紅色，加入受試物后，其顏色會(huì)逐漸變淺，因此在517 nm處可以動(dòng)態(tài)的檢測(cè)其對(duì)DPPH·的清除效果[15]。由表1可知，沙蔥水提液質(zhì)量濃度在0.39 mg/mL～3.13 mg/mL時(shí)，其清除DPPH自由基的能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，說(shuō)明其在此濃度范圍內(nèi)自由基清除能力與水提液濃度有明顯的相關(guān)性，并且各濃度的清除率之間具有顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)待測(cè)液濃度大于3.13 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除率的能力趨于平緩，且組間差異不顯著（P＜0.05），當(dāng)質(zhì)量濃度為 12.50 mg/mL 時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大（92.95±0.84）%，由圖3得出沙蔥水提液清除DPPH自由基的IC50值為0.867 mg/mL；TEAC值為51.82 mg Trolox/g，說(shuō)明每克沙蔥干物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的抑制功效與51.82 mg Trolox的清除功效相當(dāng)。本試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)雖然低于人工合成的常用抗氧化劑Trolox，但仍然表現(xiàn)出較高的自由基清除能力。

2.3 沙蔥水提液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一組通過(guò)延緩糖的消化以降低餐后高血糖狀況的口服降糖藥，其作用特點(diǎn)是在糖消化的最后一步抑制雙糖降解為單糖[16]。沙蔥水提液在不同濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性如表2所示。

表2 沙蔥水提液在不同濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 2 The α-glucosidase inhibitory effects of Allium mongolicum Regel aqueous extract in different concentration

沙蔥水提液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的IC50擬合曲線如圖4所示。

圖4 沙蔥水提液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.4 Inhibitory activity of Allium mongolicum Regel aqueous extract against α-glucosidase

從表2與圖4可以看出，沙蔥水提液質(zhì)量濃度在62.50 mg/mL～500.00 mg/mL時(shí)，其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率隨著質(zhì)量濃度的增大而增大，說(shuō)明其在此濃度范圍內(nèi)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用與提取物濃度有明顯的相關(guān)性，并且各濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制率之間的差異具有顯著性（P＜0.05）；當(dāng)質(zhì)量濃度為500 mg/mL時(shí)，其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率達(dá)到（70.50±1.53）%，抑制α-葡萄糖苷酶活性的IC50值為326.29 mg/mL。說(shuō)明沙蔥對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用。

2.4 沙蔥對(duì)胰脂肪酶的抑制活性

胰脂肪酶是人類消化脂肪的主要酶，應(yīng)用胰脂肪酶抑制劑可有效抑制胰脂肪酶對(duì)脂肪的分解催化作用，達(dá)到減少脂肪吸收、控制和治療肥胖的目的[17]。沙蔥水提液在不同濃度下的胰脂肪酶抑制活性如表3所示。

表3 沙蔥水提液在不同濃度下的胰脂肪酶抑制活性Table 3 The pancreatic lipase inhibitory effects of Allium mongolicum Regel aqueous extract in different concentration

沙蔥水提液對(duì)胰脂肪酶活性抑制作用的IC50擬合曲線如圖5所示。

從表3可以看出，沙蔥水提液對(duì)胰脂肪酶活性具有很好的抑制作用，當(dāng)待測(cè)液質(zhì)量濃度為62.50 mg/mL時(shí)，對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率較低，為（17.70±1.17）%，但隨著質(zhì)量濃度的增大，其抑制活性逐漸增強(qiáng)，4組數(shù)據(jù)比較具有顯著性（P＜0.05）；當(dāng)質(zhì)量濃度為500 mg/mL，其對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率就達(dá)到較高的水平，為（90.89±1.82）%，說(shuō)明其對(duì)酶活性的抑制呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性。由圖5的擬合曲線可以得出沙蔥水提液胰脂肪酶抑制活性的IC50值為179.41 mg/mL。

圖5 沙蔥水提液對(duì)胰脂肪酶的抑制活性Fig.5 Inhibitory activity of Allium mongolicum Regel aqueous extract on pancreatic lipase

3 討論

本研究以純水對(duì)脫脂沙蔥干粉進(jìn)行提取，三氯化鋁比色法測(cè)定得到其總黃酮含量為4.02 mg QE/g DW。此數(shù)據(jù)結(jié)果與薩茹麗等所做的研究結(jié)果大致相符[18]。黃酮的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)苯環(huán)（A環(huán)和B環(huán)）以雜環(huán)吡喃酮環(huán)鏈接的15碳骨架，由于其苯環(huán)上的羥基極易失去氫電子，可作為良好的電子供體而發(fā)揮抗氧化功能[19]。沙蔥待測(cè)液對(duì)DPPH·清除能力的IC50值為0.883 mg/mL。一般認(rèn)為如果某種物質(zhì)的IC50值小于10 mg/mL，那么該物質(zhì)就具備抗氧化能力[20]。故可初步判定沙蔥具有良好的抗氧化能力。

α-葡萄糖苷酶抑制劑可競(jìng)爭(zhēng)性抑制小腸內(nèi)各種α-葡萄糖苷酶，減慢淀粉類分解為葡萄糖的速率，可減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后血糖水平的升高，從而減少高血糖對(duì)胰腺的刺激，提高胰島素敏感性，有效預(yù)防并改善糖代謝相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展[21]。市面上常見(jiàn)的α-葡萄糖苷酶抑制劑，如已廣泛應(yīng)用于臨床的阿卡波糖、伏格列波糖等對(duì)餐后高血糖都有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用，但長(zhǎng)期服用可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的副作用[22]。研究表明，多種蔥屬植物在降糖方面都有功效，如大蒜、洋蔥等，在α-葡萄糖苷酶活性抑制方面都有較強(qiáng)的功能[23]。本研究也發(fā)現(xiàn)沙蔥具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，并且隨著質(zhì)量濃度的增高，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性逐漸增強(qiáng)，這為從天然產(chǎn)物中獲取α-葡萄糖苷酶抑制劑提供了新思路。

脂肪是產(chǎn)能系數(shù)最高的膳食營(yíng)養(yǎng)素，而膳食脂肪只有經(jīng)過(guò)胰脂肪酶消化分解才能被人體吸收，對(duì)胰脂肪酶抑制活性的測(cè)定是評(píng)判天然產(chǎn)物作為抗肥胖藥物潛在功效中研究最廣泛的機(jī)制之一[24]。已有研究表明蔥屬植物中洋蔥等在降脂減肥方面具有很好功效[24]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)沙蔥待測(cè)液濃度為500 mg/mL時(shí)，對(duì)胰脂肪酶活性的抑制率達(dá)到90.89%，說(shuō)明其對(duì)胰脂肪酶具有很好的酶抑制作用，鑒于胰脂肪酶活性與肥胖之間的密切聯(lián)系，沙蔥在抑制脂肪分解、降低能量攝入和調(diào)節(jié)脂代謝等方面可能具有潛在功效。

4 結(jié)論

本研究測(cè)定得到沙蔥水提液中含有較多的黃酮類化合物，自由基清除試驗(yàn)說(shuō)明沙蔥具有良好的體外抗氧化能力，并且其對(duì)胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用較顯著。α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶分別負(fù)責(zé)體內(nèi)脂肪和糖類的水解，因此，沙蔥作為天然植物來(lái)源的α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶抑制劑，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)糖脂代謝和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為糖尿病和肥胖的治療劑或輔助劑的潛力，對(duì)其功效成分和生理功能的研究有較好的理論和實(shí)踐價(jià)值。