LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中4種非典型抗精神分裂藥物及2種代謝物

劉文榮,莊緒慧,孫合園,朱麗萌,康毅敏,王 帆,王文艷

(1.煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)精神醫(yī)學(xué)研究室,呼和浩特 010110;3.北京大學(xué)北京回龍觀醫(yī)院,北京 100096)

精神分裂癥是一種慢性、致殘性、終生性的疾病,需要長(zhǎng)期維持治療[1]．非典型抗精分裂藥物如利培酮(risperidone)、氯氮平(clozapine)、奧氮平(olanzapine)和阿立哌唑(aripiprazole)等是精神分裂癥的主要一線治療藥物．精神分裂癥的主要治療策略是抗精神病藥物單藥治療(AMP)和抗精神病藥物多藥治療(APP,同時(shí)聯(lián)用至少2種抗精神分裂藥物)．盡管精神分裂癥治療指南推薦采用AMP[1],臨床上常采用APP來增加療效并改善非典型抗精神病藥治療的服藥依從性問題[2-3],但是多藥聯(lián)用可能引起臨床上的藥物-藥物相互作用(DDI)[4-5]．據(jù)報(bào)道,利培酮、阿立哌唑、氯氮平和奧氮平可經(jīng)CYP2D6、CYP3A4或CYP1A2代謝且均為P-糖蛋白的底物[6-8],可能發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制引起臨床相關(guān)的DDI．

目前,有許多研究報(bào)道了同時(shí)測(cè)定血漿中抗精神分裂藥物濃度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法[9-12],這些方法主要應(yīng)用于常規(guī)分析和AMP的治療藥物濃度監(jiān)測(cè)(TDM)研究,很少涉及APP．本研究的目的是建立一種LC-MS/MS方法,用于同時(shí)測(cè)定接受AMP或APP的治療穩(wěn)定期精神分裂患者血漿中的利培酮、氯氮平、奧氮平、阿立哌唑和活性代謝物9-羥基利培酮(9-hydroxyrisperidone)、脫氫阿立哌唑(dehydroaripiprazole)的穩(wěn)態(tài)濃度(cps),并從藥代動(dòng)力學(xué)的角度探討APP潛在的DDI．

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

TSQ Quantum Access型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司),配備有ESI離子源和Lcquan數(shù)據(jù)處理器;Aglient 1100系列高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司),配有四元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱;HSC-24A氮吹儀(天津恒奧科技有限公司);XS-105生物分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)．

1.2 藥品與試劑

利培酮(99.9%)和氯氮平(>98%)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(北京);阿立哌唑(99.8%)從永諾制藥公司獲得(宜昌);脫氫阿立哌唑(≥98%)從呈貢生物制品公司獲得(昆明);脫氫阿立哌唑-d8(98.8%)購(gòu)自多倫多研究化學(xué)品公司(多倫多,加拿大);9-羥基利培酮(≥98%)、奧氮平(≥98%)、利培酮-d4(98.6%)、9-羥基利培酮-d4(>99.9%)和奧氮平-d8(99.8%)均購(gòu)自Sigma公司(美國(guó));色譜純的甲醇、乙腈、異丙醇購(gòu)自Merck公司(德國(guó));其余所用試劑為分析純．

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件: 色譜柱為Agilent XDB-C18柱(150×2.1 mm,3.5 μm);流速:0.3 mL/min;柱溫箱:30 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL;流動(dòng)相:A相:乙腈(含0.01%冰乙酸),B相:水(含0.01%冰乙酸)．采用梯度洗脫的方式,梯度洗脫條件(流動(dòng)相A線性增加)如下:0～1.5 min,20%～90%A;1.5～2.0 min,90% A;2.0～2.1 min,90%～20% A;2.1～6.5%,20% A．

質(zhì)譜條件: 電噴霧離子化電離源(ESI),噴霧電壓為4 000 V;毛細(xì)管溫度為350 ℃;鞘氣和輔助氣壓力分別為30和5 psi;碰撞氣壓力為1.5 minni-Torr．每種分析物的選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)和保留時(shí)間見表1．

表1 6種分析物和4種同位素內(nèi)標(biāo)的LC-MS/MS參數(shù)Tab.1 The optimized LC-MS/MS parameters of six analytes and four isotope Internal standard

2.2 儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

儲(chǔ)備液的配制:分別精密稱取利培酮、9-羥基利培酮、阿立哌唑、脫氫阿立哌唑、氯氮平、奧氮平約5 mg,用甲醇稀釋至10 mg/mL,作為儲(chǔ)備液．利培酮-d4、9-羥基利培酮-d4、奧氮平-d8、脫氫阿立哌唑-d8為100 μg/mL的甲醇溶液．取每種分析物的儲(chǔ)備液適量,混合,用甲醇連續(xù)稀釋以制備所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控工作液．同法制備混合的內(nèi)標(biāo)工作液．所有儲(chǔ)備液和工作溶液均置于4 ℃冰箱中備用．

2.3 血漿樣品處理

精密移取25 μL血漿樣品置于干凈的10 mL玻璃管中,加內(nèi)標(biāo)工作液5 μL和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液25 μL,渦旋30 s,加3 mL混合提取液(正己烷∶二氯甲烷∶異丙醇=2/1/0.1,v/v/v),渦旋震蕩3 min,混合物以2 000×g離心10 min,將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至干凈的玻璃管中并于35 ℃空氣流吹干,加入200 μL流動(dòng)相A∶B(50∶50,v/v)復(fù)溶并在16 200×g下離心10 min,取5 μL進(jìn)樣分析．

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

根據(jù)《中國(guó)藥典》(2015版)生物樣品定量分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證,驗(yàn)證的內(nèi)容主要包括專屬性、殘留效應(yīng)、線性范圍、精密度準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性和稀釋可靠性[18]．

2.5 樣品來源

共收集到46位患者的血漿樣品,28人接受AMP,18人接受APP(利培酮與阿立哌唑、利培酮與氯氮平、氯氮平與奧氮平聯(lián)用各6人)．所有患者均服用抗精神分裂藥至少1個(gè)月且無酗酒、吸毒或重大器質(zhì)性疾病．穩(wěn)態(tài)下的血液樣品收集時(shí)間為早上8點(diǎn)(除阿立哌唑組取血時(shí)間是服藥后24 h外,其余用藥組均為服藥后12 h)．離心分離血漿并保存于-20 ℃待測(cè)．本研究經(jīng)內(nèi)蒙古第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),參加本次研究的患者在入組前本人或其家屬均已簽署知情同意書．

2.6 數(shù)據(jù)分析

C/D ratio的結(jié)果用Mean±SD進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析．采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(SPSS 17.0)比較AMP和APP的C/D ratio的差異．P<0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

3 結(jié)果與討論

3.1 方法開發(fā)

在該方法中,使用25 μL血漿進(jìn)行分析,能達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道200 μL血漿體系的相似的靈敏度[13]．采用液-液萃取(LLE)方法,用混合溶劑正己烷-二氯甲烷-異丙醇(2/1/0.1)純化樣品,該方法比文獻(xiàn)報(bào)道的固相萃取經(jīng)濟(jì)快速[14],且提取回收率約90%．此外,同位素內(nèi)標(biāo)具有與分析物相似的電離和提取效率,確保了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠．

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 專屬性 通過分析來自6個(gè)不同供體的空白血漿來考察方法的專屬性．結(jié)果表明,在測(cè)定條件下,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物的測(cè)定,所有分析物和內(nèi)標(biāo)均無相互干擾,代表性色譜圖如圖1所示．

1—10分別為奧氮平-d8、奧氮平、9-羥基利培酮-d4、9-羥基利培酮、利培酮-d4、利培酮、氯氮平、脫氫阿立哌唑-d8、脫氫阿立哌唑、阿立哌唑

3.2.2 線性范圍、定量下限和殘留效應(yīng) 將5 μL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液加至25 μL空白血漿中制備相當(dāng)于血藥濃度氯氮平、奧氮平、阿立哌唑和脫氫阿立哌唑?yàn)?、10、20、40、100、200、400、1 000 ng/mL;利培酮和9-羥基利培酮為0.4、1、2、4、10、20、40、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí),制備一個(gè)空白樣品和一個(gè)零濃度樣品(含內(nèi)標(biāo))．在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度樣品進(jìn)樣后分析空白樣品來考察殘留效應(yīng)．結(jié)果表明所有標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)大于0.995 8．此外,在最高濃度樣品進(jìn)樣后,空白樣品中所有分析物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間處無明顯色譜峰,表明無殘留．制備定量下限樣品每分析6批樣本,連續(xù)3個(gè)分析批考察定量下限,結(jié)果如表2所示,每個(gè)分析物定量下限的批內(nèi)批間精密度(用CV表示)均小于12.0%,準(zhǔn)確度(用RE表示)在±13.4%以內(nèi)．

3.2.3 精密度和準(zhǔn)確度 配制氯氮平、奧氮平、阿立哌唑、脫氫阿立哌唑低(10 ng/mL)、中(100 ng/mL)、高(800 ng/mL),利培酮和9-羥基利培酮低(1 ng/mL)、中(10 ng/mL)、高(80 ng/mL)濃度質(zhì)控樣品,按照2.3項(xiàng)下方法處理,每濃度點(diǎn)6平行,連續(xù)3個(gè)分析批進(jìn)行批內(nèi)批間的精確度和準(zhǔn)確度．結(jié)果如表2所示,6種分析物的CV值小于13.8%,RE值在±12.5%之內(nèi)．該方法精密度和準(zhǔn)確度符合要求．

3.2.4 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)效應(yīng)的考察通過將內(nèi)標(biāo)和低或高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液加入到6個(gè)不同來源的經(jīng)預(yù)處理的空白血漿中,配制成相當(dāng)于低、高質(zhì)控濃度的樣品,并制備相應(yīng)濃度的不含基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,比較含基質(zhì)樣品中每種分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比與相應(yīng)工作溶液中的峰面積比．基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果表明,6種分析物經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的平均基質(zhì)效應(yīng)在低濃度下為94.0%～112.4%,在高濃度下為83.9%～91.9%,并且各濃度下的CV值均低于13.7%,無明顯基質(zhì)效應(yīng)．

表2 LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中六種分析物方法的精密度和準(zhǔn)確度Tab.2 Precision and accuracy of LC-MS/MS method for determination of six analyzes

3.2.5 穩(wěn)定性和稀釋可靠性 配制低、高濃度質(zhì)控,分別考察室溫放置2 h、自動(dòng)進(jìn)樣器放置6 h、3次凍融循環(huán)和-20 ℃放置6個(gè)月的穩(wěn)定性,每種條件下每濃度3樣本平行．此外,制備高于定量上限2倍的血漿樣品并在預(yù)處理時(shí)用空白血漿稀釋2.5倍來考察稀釋可靠性．各分析物在不同放置條件下穩(wěn)定性考察的結(jié)果見表3,所有分析物在上述條件下RE%在-5.9%至11.6%之間,CV均低于12.5%．表明,所有分析物在上述條件下穩(wěn)定．稀釋2.5倍后每種分析物的RE在±7.5%內(nèi)且CV小于12.4%,表明稀釋穩(wěn)定性良好．

3.3 臨床樣品分析

表3 不同條件下6種分析物在人血漿中的穩(wěn)定性(Mean±SD) (n=3)Tab.3 Stability of six analytes in human plasma under different conditions (Mean±SD) (n=3)

該方法已成功應(yīng)用于采用AMP或APP的治療穩(wěn)定期精神分裂癥患者血漿樣品分析．6.5%(3/46)患者的Cps超過TDM指南制定的實(shí)驗(yàn)室警戒水平[15]．WANG等報(bào)道中國(guó)患者氨磺必利的Cps明顯高于警戒水平[12]．因此,有必要開展中國(guó)抗精神病藥物的TDM研究,制定相應(yīng)的TDM指南．

C/D ratio廣泛用于直接比較受試者內(nèi)部和受試者之間的差異,而不考慮服藥劑量的變化,故本實(shí)驗(yàn)采用C/D ratio比較AMP和APP之間的差異[16]．因利培酮主要經(jīng)CYP2D6和CYP3A4代謝為9-羥基利培酮,該代謝物具有與母體化合物相似的藥理活性[17],故分別比較了利培酮、9-羥基利培酮和總活性物質(zhì)(利培酮與9-羥基利培酮之和)的C/D ratio．利培酮AMP組(n=14)利培酮、9-羥基利培酮、總活性物質(zhì)的C/D ratio分別為1.34±1.20、13.17±6.52、17.17±9.84 ng/(mL·mg-1),APP組(n=12)分別為1.92±1.37、6.69±3.14、8.62±4.33 ng/(mL·mg-1),9-羥基利培酮和總活性物質(zhì)的C/D ratio顯著低于AMP(P分別為0.006和0.014)而利培酮無顯著性差異(P=0.284),結(jié)果見圖2．無論利培酮與氯氮平還是與阿立哌唑聯(lián)用,對(duì)利培酮、9-羥基利培酮和總活性物質(zhì)C/D ratio的影響趨勢(shì)相同．這可能是因?yàn)镃YP2D6和CYP3A4是利培酮、阿立哌唑和氯氮平共同的代謝酶,氯氮平和阿立哌唑競(jìng)爭(zhēng)抑制利培酮的代謝,體外實(shí)驗(yàn)也有報(bào)道氯氮平對(duì)CYP2D6有抑制作用[18]．此外,利培酮的消除半衰期(約3 h)遠(yuǎn)低于其代謝物9-羥基利培酮(約24 h)[19]．對(duì)于氯氮平組,AMP組(n=14)C/D ratio為2.77±1.04 ng/(mL·mg-1),APP組(n=12)為2.81±1.92 ng/(mL·mg-1),無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果如圖2所示,表明APP治療方式對(duì)氯氮平無影響．

圖2 AMP和APP組C/D ratio箱式圖比較Fig.2 The box figure of C/D ratio in AMP and APP medations

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了快速、靈敏、可靠的LC-MS/MS方法用于同時(shí)測(cè)定精神分裂患者血漿中4種抗精神分裂藥物和2種代謝物濃度,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證．結(jié)果表明,當(dāng)利培酮與氯氮平或阿立哌唑合并用藥時(shí)可能發(fā)生DDI．有必要進(jìn)一步研究阿立哌唑,利培酮和氯氮平體內(nèi)和體外的競(jìng)爭(zhēng)性抑制,并探討APP的可行性．