糞大腸菌群檢測分析酶底物法

欒盛媛 張偉薇 張麗麗 張 振

（1黑龍江省同江市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站 黑龍江同江 156400 2黑龍江省三江環(huán)境監(jiān)測站 黑龍江同江 156400 3黑龍江省佳木斯市湯原縣環(huán)境保護(hù)局 黑龍江佳木斯 154700）

1 方法原理

在特定溫度下培養(yǎng)特定的時(shí)間，糞大腸菌群能產(chǎn)生酶底物法采用大腸菌群細(xì)菌能產(chǎn)生β－半乳糖苷酶，將選擇性培養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯β－D－吡喃半乳甘糖分解黃色的鄰硝基苯酚，在紫外燈照射下產(chǎn)生熒光。統(tǒng)計(jì)陽性反應(yīng)出現(xiàn)的數(shù)量，查MPN圖表，在將其計(jì)算出樣品中糞大腸菌群的濃度值。其酶底物法檢出限是 10MPN／L。

2 實(shí)驗(yàn)室用水

實(shí)驗(yàn)室用水為無菌水，取來適量的純凈水，放在燒杯中，經(jīng)過121攝氏度，高壓蒸汽滅菌，需要20分鐘。

3 采樣瓶的清洗準(zhǔn)備

（1）是新購買的500ml具旋帽或者是磨口塞得廣口玻璃瓶，應(yīng)在百分之二的鹽酸中浸泡幾個(gè)小時(shí)，還需要用自來水沖洗干凈，再用純凈水清洗1-2次，控干，備用。

（2）將清洗干凈干燥的采樣器，用專用的紙包裹起來，放入恒溫干燥箱內(nèi)，將溫度設(shè)置到121攝氏度，滅菌20分鐘，烘干。滅菌完成后，還需要關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室電源待溫度降到50攝氏度以下時(shí)，方可開門取樣品瓶，不然，玻璃瓶會因?yàn)椴僮鞑划?dāng)爆裂。

4 樣品的采集及保存

（1）單獨(dú)采樣，優(yōu)先采樣。使用已經(jīng)準(zhǔn)備好的采樣瓶，采樣。在采樣的過程中產(chǎn)樣瓶不用再進(jìn)行沖洗。

（2）在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行采樣，以免不同層次的攪擾。

（3）水樣的保存條件及時(shí)間：水樣應(yīng)在10攝氏度以下冷藏保存；應(yīng)盡快分析，最長時(shí)間不能超過6個(gè)小時(shí)。

（4）化驗(yàn)員接樣后，不能立即檢測，應(yīng)將樣品與4攝氏度以下冷藏并在2小時(shí)內(nèi)檢測。

5 分析樣品

5.1 樣品稀釋

需要根據(jù)樣品污染程度確定接種量，避免接種樣品培養(yǎng)后97孔定量盤出現(xiàn)全部陽性或全部陰性。在接種量小于100ml的時(shí)候，應(yīng)稀釋樣品后再進(jìn)行接種試驗(yàn)，接種量為10ml的時(shí)候，取10ml樣品加入到90ml無菌水的三角瓶中混合均勻制成1:10的稀釋樣品，其他接種量的稀釋樣品依次類推。在未知樣品，可選用多個(gè)接種量進(jìn)行檢測。

5.2 接種

量取100ml樣品或是稀釋樣品與滅菌后的三角瓶，再加入2.7克+-0.5克培養(yǎng)基粉末，在充分?jǐn)嚢杌靹?，等完全溶解，在將其全部倒?7孔定量盤內(nèi)，以手扶平97孔定量盤背面，趕出孔內(nèi)氣泡，然后，用程控定量封口機(jī)封口。觀察97孔定量盤顏色，若出現(xiàn)類似或者深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤的顏色，則還需要進(jìn)行樣品排查、培養(yǎng)基無菌水等一系列因素后，終止實(shí)驗(yàn)或重新實(shí)驗(yàn)。

5.3 培養(yǎng)

測定糞大腸菌群時(shí)，將封口后的97孔定量盤，放入恒溫培養(yǎng)箱中，在44.5攝氏度+-0.5攝氏度下，培養(yǎng)24小時(shí)。

5.4 對照實(shí)驗(yàn)

（1）空白對照

每次實(shí)驗(yàn)都要用無菌水按照分析步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測定。培養(yǎng)后的97孔定量盤不得有任何顏色，不然，該實(shí)驗(yàn)失敗，應(yīng)重新測定。

（2）陽性與陰性對照

將糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300-3000個(gè)／ml的菌懸液，將菌懸液按接種和培養(yǎng)要求操作，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)；否則，結(jié)果無效，實(shí)驗(yàn)失敗，重新測定。

（3）結(jié)果判讀及計(jì)數(shù)和有效位數(shù)的要求

將培養(yǎng)24小時(shí)的97孔定量盤進(jìn)行結(jié)果讀數(shù)，樣品出現(xiàn)變黃色判斷為糞大腸菌群陽性。測定結(jié)果保留2位有效數(shù)字。

5.5 結(jié)果計(jì)算與表示

從97孔定量盤法MPN表中查的每100ml水樣中糞大腸菌群的MPN值，在根據(jù)樣品稀釋度不同，按照公式換算樣品中糞大腸菌群濃度。

結(jié)語

本文通過對糞大腸菌群檢測方法酶底物法以其操作簡便、檢測周期短將在未來取代多管發(fā)酵法、濾膜法等傳統(tǒng)方法，尤其是酶底物法采用密封培養(yǎng)技術(shù)。