上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料應(yīng)用進展及其檢測系統(tǒng)的研究

陳婷婷，杜民，陳建國，甘振華，柯棟忠，黃美蘭

1. 福州大學(xué) a. 物理與信息工程學(xué)院；b. 福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術(shù)重點實驗室；c. 電氣工程與自動化學(xué)院；d. 生物科學(xué)與工程學(xué)院；福建 福州 350108；2. 福建工程學(xué)院 福建省汽車電子與電驅(qū)動技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350118

引言

上轉(zhuǎn)換發(fā)光（Upconversion Luminescence，UCL）是一種稀土離子吸收2個或2個以上的低能光子而輻射高能光子的發(fā)光現(xiàn)象，屬于反斯托克斯發(fā)光[1]。在20世紀50年代末，這種在紅外光激發(fā)下能發(fā)出可見光的上轉(zhuǎn)換納米材料被首次發(fā)現(xiàn)[2]，直到在20世紀90年代后期，隨著納米科技的興起，人們開始將其作為一種紅外光轉(zhuǎn)可見光的材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測和食品安全等多個領(lǐng)域[3-4]。

1 上轉(zhuǎn)換熒光納米材料發(fā)光機理和特點

1.1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光機理

2004年，Auzel[2]將上轉(zhuǎn)換發(fā)光機制歸結(jié)為以下4種：激發(fā)態(tài)吸收上轉(zhuǎn)換、能量傳遞上轉(zhuǎn)換、直接雙光子吸收上轉(zhuǎn)換和光子雪崩上轉(zhuǎn)換。激發(fā)態(tài)吸收（Excited State Absorption，ESA）在1959年被提出，屬于單個離子的吸收，指的是處于基態(tài)的離子通過吸收多個低能量的光子達到激發(fā)態(tài)，之后由激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)，輻射出比激發(fā)光波更短、能量更高的光子。

根據(jù)傳遞方式的不同將能量傳遞（Energy Transfer，ET）分為連續(xù)能量轉(zhuǎn)移、協(xié)同上轉(zhuǎn)換、交叉馳豫。能量傳遞上轉(zhuǎn)換過程是離子之間的相互作用，與激發(fā)態(tài)吸收上轉(zhuǎn)換不同的是要依賴于離子濃度，為了保證能量傳遞的發(fā)生離子濃度必須足夠的高。

直接雙光子吸收指的是離子吸收光子，沒有中間亞穩(wěn)態(tài)直接從基態(tài)躍遷到終態(tài)，輻射出能量高的光子。

1979年，Chivian等[5]在研究LaCl3晶體中上轉(zhuǎn)換發(fā)光時首次提出光子雪崩上轉(zhuǎn)換，指的是在能量傳遞上轉(zhuǎn)換過程，處于中間的亞穩(wěn)態(tài)像雪崩一樣急劇增加，當(dāng)離子濃度達到足夠高時，躍遷回基態(tài)時會輻射短波長的光子的過程。

1.2 上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的發(fā)光特點

相對于傳統(tǒng)以有機染料和半導(dǎo)體量子點作為下轉(zhuǎn)換發(fā)光材料，隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，上轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為新一代生物熒光標記具有的顯著優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面。

（1）化學(xué)穩(wěn)定性高，不易被光漂白，易于長時間的觀察。有機染料常用的如異硫氰酸熒光素FITC及花菁染料Cy3和Cy5[6]，其光學(xué)穩(wěn)定性較差，易發(fā)生光漂白。由于稀土上轉(zhuǎn)換材料采用稀土氟化物、硫化物、氧化物等這些材料的穩(wěn)定性好，易于長時間的觀察[7]。

（2）水溶性好、毒性低。隨著上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的不斷引入與研究，2010年復(fù)旦大學(xué)Xiong等[8]通過實驗研究表明可以將其安全地用于生物活體成像研究中。隨著水溶性稀土化合物的合成解決了早期上轉(zhuǎn)換熒光納米材料存在的水溶性差、顆粒尺寸較大等相關(guān)問題[9]。

（3）采用近紅外作為其激發(fā)源，解決了穿透深度低、傷害生物組織的問題[10]。采用近紅外（650～1100 nm）作為激發(fā)源，與傳統(tǒng)的可見光區(qū)域的熒光成像對比，組織的穿透深度提高了5～10 mm[11]。同時采用近紅外作為激發(fā)源屬于長波激發(fā)解決了紫外激發(fā)對生物組織長時間照射引起對生物組織傷害的問題[12]。

（4）發(fā)射光譜特性突出，熒光量子產(chǎn)生率高（3.1%），反斯托克位移較大，一般在200 nm以上[13]。較大的反斯托克位移使激發(fā)光不會干擾探測信號的接收，提高了檢測靈敏度，同時窄帶濾波片的易配能夠節(jié)約成本。

（5）熒光壽命較長（約1 ms），是生物背景熒光壽命的105～106倍[14]。在進行時間分辨熒光顯微成像測定和熒光壽命成像時，可以利用這種長壽命的熒光避免背景熒光的干擾。

（6）檢測靈敏度高、具有超高選擇性、解決了自發(fā)熒光干擾的問題。作為熒光標記應(yīng)用于生物標本只能觀察上轉(zhuǎn)換熒光材料本身發(fā)光，而不具備上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能的被測生物分子不發(fā)熒光，由此消除來自內(nèi)源性熒光物質(zhì)和同時標記熒光染料的背景干擾，檢測背景值降低，檢測靈敏度提高。

2 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，越來越多研究人員關(guān)注稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米材料，下面介紹目前國內(nèi)外研究者在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

2.1 生物成像

由于稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米材料優(yōu)越的化學(xué)性質(zhì)以及低毒性使其在生命醫(yī)學(xué)等方面得到廣泛運用。1999年，Zijlmans等[15]首次利用氙燈提供近紅外激發(fā)由大顆粒（200～400 nm）上轉(zhuǎn)換熒光組成的抗體，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合將前列腺組織切片進行標記，通過實驗研究發(fā)現(xiàn)采用上轉(zhuǎn)換熒光標記的組織比采用有機染料標記的組織更易識別其分布。2006年，Lim等[16]首次將50～150 nm的Y2O3：Yb3+/Er3+稀土上轉(zhuǎn)換熒光材料用于標記線蟲，但由于該熒光材料尺寸較大，導(dǎo)致其依舊不適用于動物活體成像。2008年，Chatterjee等[17]首次將上轉(zhuǎn)換納米粒子應(yīng)用于動物更深層的組織進行成像，發(fā)現(xiàn)合成的PEI-NaYF4：Yb3+/Er3+納米粒子穩(wěn)定性較好，生物毒性低同時與量子點比較其熒光強度和組織穿透能力都強于量子點。Jalil等[18]研究發(fā)現(xiàn)二氧化硅包覆的NaYF4上轉(zhuǎn)換納米晶體表現(xiàn)出良好的體外和體內(nèi)生物相容性，展示了其在細胞和動物成像系統(tǒng)中的潛在應(yīng)用。2009年，復(fù)旦大學(xué)的化學(xué)與高級材料研究所的Yu等[19]提出一種獨特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像方式，引入反向激發(fā)二向色鏡和共焦針孔技術(shù)-激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微成像，該技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢可以消除來自內(nèi)源熒光基團以及外源性熒光的干擾，靈敏度高、選擇性強、與傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡的兼容性好。2009年，Xiong等[20]實現(xiàn)了小鼠全身光發(fā)光成像的小于50個納米標記細胞的檢測極限。近年來，結(jié)合傳統(tǒng)的核磁共振成像、電腦斷層掃描、熒光分子成像等多種技術(shù)獲取具有分辨率高、成像快速、分子水平的多模式生物成像技術(shù)。如2017年，Chen等[21]研制了一種以上轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為基礎(chǔ)的膠束結(jié)合化療、光動力治療、熒光成像，通過實驗研究表明在體外和體內(nèi)都具有良好的成像能力。

2.2 生物檢測

上轉(zhuǎn)換熒光納米材料在生物檢測目前主要應(yīng)用在蛋白質(zhì)檢測、離子檢測、陰陽離子識別、檢測小分子、核酸檢測、檢測溫度、免疫分析。其檢測原理是根據(jù)上轉(zhuǎn)換熒光納米材料可以通過調(diào)節(jié)元素摻雜的濃度以及種類來調(diào)節(jié)輻射光，在具體實驗中可以先制備所需的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為供體，然后選擇能量受體通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）來實現(xiàn)對目標物的檢測。2005年，Wang等[22]最早基于FRET過程來檢測親和素濃度，在實驗中將生物素連接的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為供體，Au納米粒子作為受體；Kuningas等[23]研究的一種基于FRET過程的檢測17β-雌二醇，將上轉(zhuǎn)換熒光材料作為供體，小分子染料作為受體；Liu等[24]研究一種利用FRET過程設(shè)計的檢測谷胱甘肽（GSH）分子的方法；Wu等[25]結(jié)合磁性納米顆粒和雙光子分別與捕獲的DNA和報告的DNA結(jié)合，檢測腸道病毒71和柯薩奇病毒A16；隨后在2013年，Liu等[26]又研究的一種將花青染料hCy7和UCNPs的熒光探針用于甲基汞的檢測；Hemmer等[27]研究的一種用UCNPs和有機染料來檢測亞細胞水平的溫度的納米溫度計；Ju等[28]研究將單鏈DNA和LiYF4結(jié)合，制備DNA探針，用于定量檢測目標DNA；Wu等[29]研究的一種基于上轉(zhuǎn)換熒光材料與石墨烯結(jié)合的FRET的基礎(chǔ)上的生物傳感器用于檢測艾滋病抗體；Rijke等[30]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)上轉(zhuǎn)換熒光標記檢測核酸的靈敏度是有機染料Cy5標記的4倍。雖然目前稀土上轉(zhuǎn)換納米材料用于生物檢測的取得一些成果但與傳統(tǒng)的有機染料以及量子點而言依舊是處于研究的初步階段。

2.3 光動力治療

光動力效應(yīng)是光動力治療的作用基礎(chǔ)，是一種有氧分子參與的伴隨生物效應(yīng)的光敏化反應(yīng)，其基本要素是氧、光敏劑和可見光。近幾年，上轉(zhuǎn)換熒光納米材料在光動力治療方面被廣泛運用[31]。早期，Zeng等[32]研究的利用上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒表面依附光敏劑AIPcS4從而達到光動力學(xué)治療的目的；Wang等[33]研究一個應(yīng)用于小鼠活體實驗的上轉(zhuǎn)換納米材料基的光動力學(xué)治療體系；Qiao等[34]將三官能核殼結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子與光敏劑共價接用于熒光成像、磁共振成像和光動力學(xué)治療。最近，Liu等[35]研究的基于上轉(zhuǎn)換納米粒子的熱膠束雙模成像和光動力治療肝癌，該研究中使用一種抗腫瘤藥物和光敏劑mitoxantrone（MX）將其與抗EpCAM抗體接枝的上轉(zhuǎn)換納米膠束，用于雙模式磁共振/上轉(zhuǎn)換發(fā)光（Mr/UCL）引導(dǎo)的協(xié)同化療和光動力療法通過實驗研究證實該膠束具有良好的生物相容性，具有專一性和優(yōu)良的熒光與磁性。

2.4 藥物運輸與釋放

藥物運輸通過上轉(zhuǎn)換發(fā)光與裝載藥物的光響物質(zhì)，形成近紅外激發(fā)的藥物釋放。Zhang等[36]研究出一種具有磁性和上轉(zhuǎn)換性質(zhì)的介孔型稀土上轉(zhuǎn)換熒光納米材料，通過實驗研究表明該材料可用于藥物的傳輸；Xing等[37]用硅涂層上轉(zhuǎn)換納米粒子自組裝光反應(yīng)共聚物制備了一種納米復(fù)合材料，實現(xiàn)了近紅外光控制藥物釋放和癌癥治療。

目前國內(nèi)外對于上轉(zhuǎn)換熒光納米材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用依舊擁有極大的潛力，發(fā)展前景巨大，研究的趨勢朝著診療一體化、聯(lián)合治療方向發(fā)展。

3 上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)的研究

隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展以及上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的獨特優(yōu)勢，吸引了國內(nèi)外開始對上轉(zhuǎn)換發(fā)光檢測系統(tǒng)的研制。

早期，Zijlmans等[15]首次利用氙燈提供近紅外激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光粉粒子，采用改進型的熒光顯微鏡，通過將配有75 W氙燈的Leica DMR-LB直立型熒光顯微鏡移除KG系列的“熱鏡”和BG-38的“紅阻”但令其團隊發(fā)愁的是后期需要昂貴的儀器來檢測化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的短暫的光。

2006年，Lim等[16]采用20×，0.4 NA物鏡（Nikon，Melville，NY）和一種強度耦合CCD相機的倒置顯微鏡對線蟲的上轉(zhuǎn)換發(fā)光進行了紅外激發(fā)成像，最后用光纖耦合CCD光譜儀（海洋光學(xué)，Dunedin，F(xiàn)L）采集上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜。

2008年，Chatterjee等[17]采用980 nm的VA-Ⅱ型全固態(tài)態(tài)半導(dǎo)體激光器作為激發(fā)源（1.0 A)在暗室中觀察到發(fā)光，并用帶有熱濾光片的CCD數(shù)碼相機進行記錄，以消除近紅外散射。次年Salthouse等[38]研發(fā)第一個小型動物上轉(zhuǎn)換成像儀用于上轉(zhuǎn)換納米粒子體內(nèi)成像，該儀器用980 nm激光二極管（300 mW）作為激發(fā)光，激光被準直、過濾和擴散，圖像由攝像機拍攝，通過鏡頭組件進行聚焦，然后用激光濾光片進行濾波。

2009年，Lia等[39]搭建一個由具有平行板的小動物成像室、激光器、具有聚焦光學(xué)器件的Galvo控制光學(xué)掃描器、成像遠心透鏡和攝像機組成的系統(tǒng)。將來自激光二極管的光通過適當(dāng)?shù)膸V波器濾波，隨后聚焦到成像室的一個板的特定斑點上。發(fā)射的熒光信號用長通或短程濾波器（分別為Cy5.5或unp）與適當(dāng)?shù)膸V波器相結(jié)合進行濾波最后采用高靈敏度的CCD攝像機采集圖像。經(jīng)過實驗研究表明將上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒用于生物活體成像并未受到來自自發(fā)熒光的干擾。

2010年，Xiong等[8]采用改良的Olympus FV1000激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡5對細胞進行共聚焦成像，該顯微鏡配有連續(xù)波激光器，波長為980 nm，采用60×浸油物鏡。經(jīng)過實驗研究用β-NaLuF(4)：Gd(3+)，Yb(3+)，Tm(3+)納米晶體作為發(fā)光，實現(xiàn)了小鼠全身光發(fā)光成像的＜50個納米標記細胞的檢測極限。2009年，復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系與復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院[20]搭建一個上轉(zhuǎn)換納米顆粒用于小動物活體成像的系統(tǒng)，在980 nm處發(fā)射的連續(xù)波激光由電流計反射鏡定向，然后由物鏡（60×浸油物鏡）進入標本。從掃描點的位置發(fā)射的光被電流計反射鏡偏轉(zhuǎn)，然后通過反向激發(fā)二向色鏡與激發(fā)分離，然后通過共焦針孔，并最終進入光電倍增管（PMT，R6357增強型）作為探測器。通過實驗研究表明上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像技術(shù)適用于跟蹤和標記復(fù)雜生物系統(tǒng)的組件。

近期,芬蘭的Labrox和Hidex公司研究一種上轉(zhuǎn)換熒光探針專用的數(shù)字化顯示讀出設(shè)備[40]；國內(nèi)針對上轉(zhuǎn)換實際應(yīng)用的檢測設(shè)備研發(fā)方向主要以免疫分析儀為主[41]。如中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機械研究所和解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究的上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)生物傳感器、上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫試紙掃描檢測系統(tǒng)[42-43]；中國解放軍白求恩醫(yī)務(wù)學(xué)校檢驗醫(yī)學(xué)教研室研究的基于面陣CCD的便攜式上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析檢測系統(tǒng)[44]。目前市面缺乏商業(yè)的專門檢測上轉(zhuǎn)換熒光納米這種材料的設(shè)備，對于如何進一步的開展建立專用針對檢測設(shè)備對上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的實際應(yīng)用具有深遠的意義。

4 結(jié)語

由于上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的顯著優(yōu)勢，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的運用。然而，目前還未有現(xiàn)成的商業(yè)熒光成像系統(tǒng)，多數(shù)情況仍采用傳統(tǒng)的熒光檢測設(shè)備進行檢測實驗。然而，傳統(tǒng)檢測設(shè)備在檢測過程中由于設(shè)備的信噪比較低使其難以準確的檢測，而且傳統(tǒng)的紅外激發(fā)器體積較大使其檢測系統(tǒng)較為笨重。隨著科技不斷的發(fā)展，政府對醫(yī)療設(shè)備的不斷關(guān)注與投入以及醫(yī)療市場的需求，未來檢測系統(tǒng)會朝著便攜化、一體化、智能化和全自動化發(fā)展。

（1）便攜化。傳統(tǒng)的紅外激發(fā)器為了確保穩(wěn)定性整個設(shè)計結(jié)構(gòu)較為笨重，可以考慮研發(fā)穩(wěn)定性好而且小巧的紅外激發(fā)光源，或者可以考慮采用無線遠程對激光器的智能控制。

（2）一體化。隨著醫(yī)療技術(shù)不斷的創(chuàng)新與發(fā)展，在今后可以考慮將多種治療方式集合在一個平臺上，集合各個治療方式的優(yōu)勢，提高檢測準確性。

（3）智能化。隨著智能設(shè)備的不斷普及以及互聯(lián)大數(shù)據(jù)時代的到來，今后可以通過互聯(lián)網(wǎng)實現(xiàn)數(shù)據(jù)的共享，實時記錄分析檢測的結(jié)果，為建立健康服務(wù)平臺提供數(shù)據(jù)。

（4）全自動化。機器設(shè)備和系統(tǒng)在沒有人或較少人的直接參與下，按照人的要求，經(jīng)過自動檢測、信息處理、分析判斷、操縱控制，實現(xiàn)預(yù)期的目標。