真菌Gliocladium roseum CGMCC 3.3657酚類次生代謝產物研究

楊彩玲，孟慶峰，王夢嬌，袁菁菁，石志宇，張 遙，付少彬

(1.遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院，貴州 遵義 563099)

粉紅粘帚霉(GliocladiumroseumBainier.)屬半知菌門，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，粘帚霉屬，是一種分布廣泛的土壤習居菌和重寄生菌，具有生長速度快、產孢量大、寄主范圍廣、寄生能力強、拮抗機制多樣等優(yōu)點[1]。粉紅粘帚霉是農業(yè)生物防治上極具潛力的生防因子之一。它能產生幾丁質酶、纖維素酶、蛋白酶等細胞壁降解酶[2]，從而侵染核盤菌、禾谷鐮刀菌、立枯絲核菌、灰葡萄孢等多種對瓜果蔬菜、觀賞性植物、水稻具有危害性的病原真菌細胞壁[3]，達到生物防治的作用，避免化學防治所帶來的環(huán)境污染、農藥殘留以及病菌抗藥性等問題。它在重金屬生物修復中也具有潛在的應用價值。Socrates等[4]研究發(fā)現G.roseum能使不溶性碳酸鉛轉化成可溶性草酸鉛，可修復采礦場周圍重金屬的污染。粉紅粘帚霉次生代謝物具有顯著的殺線蟲能力。Dong等[5]從菌株編號為YMF1.00133的粉紅粘帚霉屬小麥固體發(fā)酵物中分離出一系列具有殺線蟲作用的化合物gliocladine A-E，verticillin A，11'-deoxyverticillin A，sch52900和sch52901。Song等[6]繼續(xù)Dong等[5]的研究從G.roseumYMF1.00133小麥固體發(fā)酵物中分離得到2個具有殺線蟲活性化合物gliocladin C和5-n-heneicosylresorcinol。粉紅粘帚霉真菌在微生物轉化方面也有很好的應用前景。G.roseum可通過經濟環(huán)保、綠色可持續(xù)的方法進行生物合成球形、結晶、單分散的硒納米粒子[7]。Andrés等[8]使用G.roseumCECT 2733微生物轉化方法實現了化學方法很難實現的倍半萜-4-羥基琥珀酸-1,6-二酮C-11位羥基化的轉化獲得3個新化合物。Fu等[9]使用G.roseumCGMCC 3.3657實現了結構復雜的天然產物熊果酸飽和碳上的羥基化反應，此生物轉化新產物較熊果酸具有較好的抗HCV活性。Fu等[10]還發(fā)現G.roseumCGMCC 3.3657對刺囊酸的微生物轉化可作為改造齊墩果酸五環(huán)三萜類化合物A環(huán)的新方法。

粉紅粘帚霉應用廣泛，為了進一步闡明G.roseumCGMCC 3.3657次生代謝產物種類，挖掘該菌株代謝產物可能存在的應用價值，為新藥的開發(fā)和尋找新穎的化合物奠定基礎，本文對G.roseumCGMCC 3.3657的液體發(fā)酵產物進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent DD2 400-MR NMR型核磁共振儀(美國，Agilent公司)；Sepacore中壓制備系統(tǒng)(瑞士，BüCHI公司)；RE-2000E型旋轉蒸發(fā)儀(中國上海，上海亞榮生化儀器廠)；BS-2F型恒溫搖床(中國江蘇，常州華冠儀器制造有限公司)；SW-CJ-1D型生物凈化臺(中國蘇州，蘇州凈化儀器有限公司)；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌器(中國上海，上海博迅實業(yè)有限公司)；ZF-7型三相紫外分析儀(中國上海，上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 材料 反相C18填料(日本，日本富士硅化學株式會社)；GF254薄層色譜硅膠和300～400目柱色譜硅膠(中國青島，青島海洋化工公司)；G.roseumCGMCC 3.3657(中國微生物菌種保藏中心)，菌種PDA斜面保藏于4 ℃冰箱。

1.3 菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)和次生代謝產物的萃取 將土豆削皮切小塊加入水中煮大約30 min，用8層紗布過濾土豆湯汁，加入葡萄糖混勻分裝(土豆∶葡萄糖∶蒸餾水=1∶0.1∶5)，121 ℃高溫滅菌20 min。在無菌操作臺內將保存的G.roseumCGMCC 3.3657活化2次后挑取3小塊菌絲體連同培養(yǎng)基接種到盛有40 mL PDA培養(yǎng)液的100 mL錐形瓶內，150 r/min 28 ℃搖床培養(yǎng)4 d制作母液。同樣在無菌操作臺內將母液接種到含有400 mL培養(yǎng)液的1 L錐形瓶內，一共30 L培養(yǎng)液以同樣條件發(fā)酵培養(yǎng)15 d。發(fā)酵完成后抽濾瓶過濾菌絲體和發(fā)酵液，乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮得粗提物6.0 g。

1.4 粗提物的分離純化 粗提物6.0 g經中壓C18柱色譜(50 mm×460 mm)甲醇-水(10%→100%,v/v)梯度洗脫粗分成6部分(Fr.1～6)。Fr.3用硅膠柱層析(石油醚∶丙酮=2∶1,v/v)等度洗脫得化合物3(17 mg)和化合物4(80 mg)；Fr.4用硅膠柱層析(石油醚∶丙酮=1.5∶1,v/v)等度洗脫，得化合物1(25 mg)和化合物2(749.2 mg)。

2 結果

對絲狀真菌G.roseumCGMCC 3.3657進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，通過中壓色譜和硅膠色譜對乙酸乙酯提取物進行分離純化，得到4個苯酚類化合物(見圖1)，分別鑒定為：①對羥基苯甲醛;②對羥基苯甲酸;③3,4-二羥基苯甲酸;④3,5-二羥基苯甲酸。

A:對羥基苯甲醛; B:對羥基苯甲酸; C:3,4-二羥基苯甲酸; D:3,5-二羥基苯甲酸。圖1 化合物1-4的結構

2.1 化合物1黃色結晶，25 mg。1H NMR(400 MHz，C3D6O)δ: 9.73(1H,s,CHO-1) ,7.75(2H,d,J= 8.6 Hz,H-2,6),6.89(2H,d,J= 8.6 Hz,H-3,5)。13C-NMR(100 MHz,C3D6O)δ: 191.16(CHO),163.88(C-4),132.79(C-2,6),115.76(C-3,5)。以上數據與文獻[11]報道一致，確定化合物1為對羥基苯甲醛(PHB)。

2.2 化合物2白色粉末，749.2 mg。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ: 7.86(2H,dd,J= 8.5,1.1 Hz,H-2,6),6.82(2H,td,J= 8.0,4.4 Hz,H-3,5)。13C-NMR(100 MHz,C3D6O)δ: 167.27(C-7),161.82(C-4),131.87(C-2,6),121.57(C-1),115.10(C-3,5)。以上數據與文獻[12]基本一致，確定化合物2為對羥基苯甲酸(PHBA)。

2.3 化合物3白色粉末，17 mg。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ: 7.34(1H,d,J= 2.0 Hz,H-2),7.29 (1H,dd,J= 8.4,2.0 Hz,H-6),6.79(1H,d,J= 8.0 Hz,H-5)。13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 168.08(COOH),151.08(C-4),145.90(C-3),123.97(C-6),123.40(C-1),117.80(C-2),116.03(C-5)。以上數據與文獻[13]報道一致，確定化合物3為3,4-二羥基苯甲酸。

2.4 化合物4黃色結晶，80 mg。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ: 7.86(1H,dd,J= 8.5 Hz),6.82 (2H,td,J= 8.0,4.4 Hz)，13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 168.91(COOH),158.05(C-3,5),132.15(C-1),107.91(C-2,6),106.97(C-4)。以上數據與文獻[14]報道一致，確定化合物4為3,5-二羥基苯甲酸。

3 討論

微生物是先導化合物的重要來源，真菌是微生物的重要類群之一，種類繁多，形態(tài)各異，生活環(huán)境多樣，真菌中分離得到的代謝產物也多種多樣。從產抗生素-青霉素的青霉到產抗腫瘤藥物紫杉醇的內生真菌，真菌化學成分一度成為藥學家和化學家的研究熱點之一。本文從真菌G.roseumCGMCC 3.3657次生代謝產物中分離得到4個苯酚類化合物，其中對羥基苯甲酸的含量較高，分離得到749.2 mg，占乙酸乙酯提取物的12.5%以上，可把該菌株作為生產對羥基苯甲酸的很好的選擇方法。

簡單的羥基苯甲酸類化合物由莽草酸代謝途徑的早期中間產物3-去羥基莽草酸或分支酸合成。簡單的苯酚類化合物是重要的精細化工中間體，可作為食品、化妝品、醫(yī)藥、農藥等行業(yè)的應用原料[15]。曾有研究表明對羥基苯甲醛(PHB)具有抗血小板聚集[16]、保護血腦屏障損傷[17]、抗炎[18]的生物活性。3,4-二羥基苯甲酸又稱原兒茶酸，具有神經保護、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、抑菌、鎮(zhèn)痛等多種生物活性與藥理作用[19]。

對羥基苯甲酸(PHBA)常用于PHBA酯類化合物尼泊金的合成，尼泊金是目前使用最多的防腐劑[20]。PHBA的另外一個重要用途是其乙酸酯經熔融和固相聚縮合后獲得合成具有實用價值的液晶高分子材料[21]。國內外對對羥基苯甲酸的需求逐年上漲，開發(fā)利用可再生資源的生產工藝是當務之急。學者朱莉綜述了微生物合成對羥基苯甲酸的研究，并從生物合成經濟環(huán)保的角度認為該方法理論上要優(yōu)于其他合成方法[22]。3,5-二羥基苯甲酸(3,5-DHBA)可特異性激動HCA1受體，抑制脂肪細胞中的脂解作用，但不抑制HCA1缺陷的脂肪細胞中的脂解作用，是體內研究HCA1功能的有用工具[23]。3,5-DHBA和3-(3,5-二羥基苯基)-1-丙酸(3,5-DHPPA)可以與5-(3,5-二羥基苯基)-戊酸(3,5-DHPPTA)和2-(3,5-二羥基苯甲酰胺基)-乙酸(3,5-DHBA glycine)組合使用作為生物標記物，可提高統(tǒng)計學研究中全麥和黑麥攝入量統(tǒng)計的準確性[24]。

本研究從真菌G.roseumCGMCC 3.3657乙酸乙酯提取物中分離得到4個苯酚類化合物：①對羥基苯甲醛;②對羥基苯甲酸;③3,4-二羥基苯甲酸;④3,5-二羥基苯甲酸，均為首次從該屬真菌中分離得到，為G.roseumCGMCC 3.3657的生物活性物、次生代謝產物的應用等提供了參考價值。