豬繁殖與呼吸綜合征與豬δ冠狀病毒病混合感染的診斷

馮 宇，徐志文，朱 玲

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川 成都 611130）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以感染豬發(fā)熱、厭食，妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)弱胎和木乃伊胎等為特征的高度傳染性疾病，各種年齡豬只均可感染，尤其以仔豬最易感[1]。

豬δ冠狀病毒病的病原為豬δ冠 狀 病 毒（PDCOV），2009-2011年P(guān)DCOV在中國香港首次報(bào)道[2]；PDCOV與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等同屬于冠狀病毒，且均能引起豬群發(fā)生腹瀉，發(fā)病癥狀相似，不同的是PDCOV引起的腹瀉癥狀會(huì)相對(duì)較輕，賀東生[3]在2015年報(bào)道發(fā)現(xiàn)PDCOV-ch A毒株，證明我國也受到PDCOV的感染，且存在零星性而非暴發(fā)性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2018年3—4月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心進(jìn)行。

1.2 病料采集

本次通過臨床診斷和剖解病理變化的觀察，對(duì)疾病初步判定為豬藍(lán)耳病和豬δ冠狀病毒病，針對(duì)該兩種疾病無菌采集相關(guān)病變嚴(yán)重的器官、組織。分別采集5頭豬的肺臟、肺門淋巴結(jié)以及小腸，分別編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原診斷。

1.3 主要試劑

TaqDNA 聚合 酶 購自寶生物工程（大連）有限公司、DNA Marker DL 2000、Trizol、Taq PCR Master Mix（2×，blue dye）、PrimeScript RT Rragent Kit(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)購自寶生物（大連）有限公司。

1.4 引物合成

根據(jù)GenBank已登錄的PDCOV（KX022604.1）、PRRSV（JX512910.2）基因的核苷酸序列，利用Primer Blast各設(shè)計(jì)一對(duì)引物（表1）。引物由生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 病毒總RNA的抽提及PCR的擴(kuò)增

組織樣品分別放入勻漿器里，編號(hào)后加1 mL Trizol 裂解液進(jìn)行勻漿，充分勻漿后室溫靜置 5 min，12000 r/min，離心5 min；取上清液，加入200 μL 氯仿迅速振蕩，室溫靜置 5 min，12000 r/min，離心15 min；向最后獲得的上清液中加入等量異丙醇沉淀RNA，輕輕搖晃混勻，室溫作用10 min后，12000 r/min 離心 15 min，棄上清液，加1 mL 700 mL/L 冰乙醇，12000 r/min 離心5 min，輕輕棄去無水乙醇，自然風(fēng)干，溶解于40 μL無Rnase 水中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑諏毶锕こ蹋ù筮B）有限公司 RTPCR 試劑盒說明書合成 cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以表1的兩對(duì)引物為檢測(cè)引物PCR反應(yīng)程序分別為：PDCOV：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè) 循 環(huán)；72 ℃ 終 延伸 10 min；PRRSV：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。反 應(yīng) 體 系 均 為 ddH2O 3μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，上 下 游 引 物 各 0.5 μL， 模 板cDNA 1μL，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 目的片段的基因測(cè)序

將PCR產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與NCBI上的PDCOV和PRRSV參考序列進(jìn)行對(duì)比，分析產(chǎn)物的同源性。

表1 引物序列與產(chǎn)物長度

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

發(fā)病豬體溫升高，患豬渾身無力、消瘦，喘氣，抽搐，站立不穩(wěn)，腹瀉，精神沉郁，昏睡，腹式呼吸且糞便成黃色水樣，見圖1。

圖1 病豬臨床照片

2.2 剖檢病變

剖檢5頭發(fā)病豬，主要病變表現(xiàn)為小腸擴(kuò)張，腸壁變薄、透明，內(nèi)充滿淡黃色液體，有的小腸黏膜有出血點(diǎn)，漿膜層黃色米粒的結(jié)節(jié)，且肺部出現(xiàn)實(shí)變、肺門淋巴結(jié)腫大等，見圖2。

圖2 部分病豬小腸病變剖檢圖

2.3 病原學(xué)檢測(cè)

以1.5中獲得的cDNA為模板，1.4中合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，所擴(kuò)增的產(chǎn)物大小與預(yù)期大小一致。

2.4 目的片段的基因序列驗(yàn)證

采用RT-PCR方法擴(kuò)增目的片段，并對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，所得序列經(jīng) NCBI BLAST比較分析，結(jié)果顯示：PRRSV的擴(kuò)增序列與參考毒株（JX512910.2）的相同度為99%，PDCOV的擴(kuò)增序列與參考毒株（KX022604.1）的相同度為99%。證實(shí)本次導(dǎo)致豬群死亡的病原主要為PRRSV和PDCOV，屬于二者混合感染。

3 討論

現(xiàn)無論是大型豬場(chǎng)還是散養(yǎng)戶都無法避免PRRS的感染，其部分原因在于病毒毒株的高變異性，且發(fā)病機(jī)制往往取決于多種因素，而重要原因還是該病會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫缺陷，從而繼發(fā)感染其他疾病，使治療變得更加困難[4]。對(duì)于本次該豬場(chǎng)暴發(fā)PRRSV與PDCOV的混合感染，可能原因是該豬場(chǎng)未能正確防控PRRSV，一方面由于變異毒株的產(chǎn)生，傳統(tǒng)的疫苗接種有時(shí)不僅達(dá)不到防控效果，甚至還可能引起反向作用，增大豬場(chǎng)對(duì)PRRSV的防控壓力，各個(gè)豬場(chǎng)應(yīng)理性分析本豬場(chǎng)的PRRSV所屬類型，按照自己豬場(chǎng)生產(chǎn)經(jīng)營模式制定不同的疫苗免疫程序，而非按部就班；另一方面，PRRSV可引起機(jī)體的免疫缺陷，使得其他病毒或細(xì)菌“有機(jī)可乘”，本次案例中豬群感染PDCOV可能是因?yàn)樨i群在感染PRRSV后免疫力低下引起，所以不管任何豬場(chǎng)一定要重視PRRS，加強(qiáng)對(duì)該病的防控，落實(shí)好每一次疫苗免疫，以及抗體水平的檢測(cè)。

圖3 電泳檢測(cè)結(jié)果

PDCOV是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的引起豬腹瀉的病毒性病原。該豬場(chǎng)在發(fā)生PRRSV的基礎(chǔ)上，發(fā)生嚴(yán)重腹瀉，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)為PDCOV，且與參考毒株KX022604.1的同源性高達(dá)99%，而與香港毒株HKU15-155同源性低，表明我國PDCOV毒株可能與美國毒株有親本關(guān)系，這與賀東生[3]等的研究相一致，但由于該病毒報(bào)道少，國內(nèi)各研究所分離毒株數(shù)量少，至今尚未有可用的疫苗。美國提倡加強(qiáng)對(duì)豬群的飼養(yǎng)管理，建立完善的生物安全體系，飼喂?fàn)I養(yǎng)豐富的全價(jià)飼料，保證豬只膘肥體壯，提高機(jī)體的免疫力與抗病力，以防止該病的發(fā)生與流行。由于該病的機(jī)制和癥狀與豬流行性腹瀉類似，豬場(chǎng)可以按照防控豬流行性腹瀉的方法來防控豬δ冠狀病毒病。

總之，豬場(chǎng)應(yīng)以防為重，除了加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，落實(shí)生物安全措施之外，還應(yīng)做好免疫預(yù)防和藥物保健預(yù)防。