同源樣本一致性分析的審評(píng)要求

付文竹 陳靜 廣東省藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要： 從樣本類型、添加劑種類、樣本要求、一致性評(píng)價(jià)幾個(gè)方面對(duì)同源樣本類型的適用性進(jìn)行討論，以期給體外診斷試劑企業(yè)注冊(cè)申報(bào)及審評(píng)過程提供一些建議。

在體外診斷試劑注冊(cè)及審評(píng)時(shí)，往往會(huì)遇到產(chǎn)品適用不同樣本類型，如血清、血漿，全血、尿液等。其中尿液屬于非同源樣本，在進(jìn)行性能評(píng)估和臨床試驗(yàn)時(shí)都應(yīng)單獨(dú)評(píng)估，而血清、血漿屬于同源樣本類型，根據(jù)《免于進(jìn)行臨床試驗(yàn)的體外診斷試劑的臨床評(píng)價(jià)資料基本要求（試行）》[1]：對(duì)于具有同源性的不同樣本類型，如血清、血漿或全血樣本，可在分析性能評(píng)估中對(duì)樣本適用性進(jìn)行研究，或在臨床評(píng)價(jià)中對(duì)每種樣本類型分別進(jìn)行符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)量的評(píng)估。因此，樣本的適用性研究應(yīng)該系統(tǒng)科學(xué)的評(píng)估，而目前試劑生產(chǎn)商在做樣本適用性評(píng)估時(shí)多流于形式，評(píng)價(jià)不充分。本文將系統(tǒng)梳理在同源樣本類型的適用性研究過程中需關(guān)注的問題。

1.樣本類型及添加劑的選擇

臨床檢驗(yàn)中有時(shí)要使用全血、血漿、血清，而目前存在的問題一是把血漿、血清、全血的檢測(cè)結(jié)果視為等同，二是忽略了不同抗凝劑導(dǎo)致的某些項(xiàng)目結(jié)果差異。樣本類型根據(jù)具體檢測(cè)的項(xiàng)目往往會(huì)有一個(gè)最適樣本類型，有些檢測(cè)項(xiàng)目推薦使用血清樣本，有些項(xiàng)目血漿檢測(cè)更接近身體真實(shí)狀態(tài)，有些血清、血漿樣本均可使用，有些不同樣本類型檢測(cè)結(jié)果確實(shí)存在差異，特別是免疫類項(xiàng)目，其中全血樣本往往因?yàn)檠?xì)胞壓積對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生較大影響，并因方法學(xué)的不同，影響也不同，免疫層析法的影響低于液相法?？鼓齽┦且种蒲耗奶砑觿?，它保證血樣中待測(cè)成分在進(jìn)行分析前無明顯改變。目前對(duì)于抗凝劑的添加，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該參照《實(shí)驗(yàn)室檢查中抗凝劑的使用》合理選擇抗凝劑，某種抗凝劑對(duì)某成分的檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生明顯干擾現(xiàn)象，則應(yīng)該避免使用該抗凝劑，對(duì)于可以選用不同抗凝劑測(cè)定的物質(zhì)則應(yīng)該注意它們對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，并通過科學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行結(jié)果比對(duì)，比較不同標(biāo)本類型之間的差異。在選擇合適的抗凝劑后，還要合理控制血液和抗凝劑的比例。比例過高或過低都會(huì)影響樣本的質(zhì)量，血液比例高時(shí)，由于抗凝劑相對(duì)不足，血漿中出現(xiàn)微凝血塊的可能性增加；微凝血塊可能堵塞檢驗(yàn)儀器，影響檢驗(yàn)質(zhì)量；血液比例過低，抗凝劑相對(duì)過剩，對(duì)很多檢驗(yàn)造成嚴(yán)重影響，如血液和0.129mol/L檸檬酸鈉比例由9:1降至7:1時(shí)，APTT結(jié)果會(huì)顯著延長(zhǎng)[2]。因此在選擇抗凝劑種類時(shí)，還應(yīng)對(duì)抗凝劑的添加量進(jìn)行評(píng)估，選擇最適比例，并應(yīng)在說明書中明確出來，以供臨床單位根據(jù)需要采用合適的采血管。

除了抗凝劑之外，對(duì)于促凝劑、分離膠的添加實(shí)驗(yàn)室較少關(guān)注，而在實(shí)際臨床檢驗(yàn)過程中促凝劑、分離膠的添加導(dǎo)致采血管的不同，目前常用的血清收集采血管主要有無添加劑管、惰性分離膠促凝管和促凝管；血漿收集采血管主要有肝素鋰抗凝管、肝素鈉抗凝管、EDTA-K2抗凝管和EDTA-K3抗凝管。各個(gè)廠家生產(chǎn)的各類促凝管使用的促凝劑不盡相同，大多使用具有理化性質(zhì)的物質(zhì)作為促凝劑，如硅石粉、玻璃粉、硅碳素等，經(jīng)特殊加工制成粉劑用定量噴霧器均勻噴涂在真空采血管內(nèi)壁上，達(dá)到快速促凝的目的。不同種類的促凝劑有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，且其品種、性能、濃度直接影響血樣的性狀和檢測(cè)結(jié)果。因此，除確認(rèn)適用樣本類型外，促凝劑、分離膠等對(duì)樣本的影響也應(yīng)如抗凝劑作為試劑開發(fā)廠家充分研究的考慮因素，即對(duì)采血管的類型進(jìn)行確認(rèn)[3]。

2.樣本要求

2.1 樣本的采集及保存

在進(jìn)行同源樣本比對(duì)時(shí)，只有注重了同源性才具有可比性，即所比樣本應(yīng)為同一提供者來源，對(duì)所使用的不同樣本類型、不同采血管進(jìn)行一針多管靜脈采血，如不能立即測(cè)定時(shí)，應(yīng)規(guī)定每種樣本類型的保存方式、保存條件，并嚴(yán)格按照要求進(jìn)行保存。

2.2 樣本處理

臨床上用來檢測(cè)的同源樣本類型主要有血清、血漿、全血。血清、血漿與全血之間的差異主要是由凝血過程產(chǎn)生的，這決定了3種血液標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢查中不同的適用范圍和處理方法。血清和血漿均是不含細(xì)胞（包括血小板）等有形成分的血液液體部分，其主要區(qū)別是血清不含凝血因子和血小板，血漿則含有凝血因子。衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T225-2002《臨床化學(xué)檢驗(yàn)血液標(biāo)本的收集與處理》中，推薦采血后應(yīng)置于室溫30～60min讓其自行凝固，離心制備血清；血漿標(biāo)本要求采血后將血液注入含有相應(yīng)抗凝劑的試管中，立即混勻，混勻后可立即離心分離血漿。血清/血漿通常用（1000～1100）×g，離心10min制備[4]。對(duì)于真空采血管，尤其是血清分離膠促凝采血管，由于管內(nèi)添加有分離膠和促凝劑，大大縮短了血液凝固時(shí)間，其離心條件也十分關(guān)鍵。試劑開發(fā)商在進(jìn)行樣本一致性研究時(shí)，應(yīng)在分析性能評(píng)估中，評(píng)估樣本的離心速度、離心時(shí)間，同時(shí)建議在說明書中的樣本要求中明確。

3.統(tǒng)計(jì)分析

在確定一個(gè)物質(zhì)是否存在干擾前，評(píng)價(jià)者首先必須確定所得到的結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的樣本例數(shù)是必要的，這樣才能保證試驗(yàn)中有足夠的檢驗(yàn)效能能檢出有臨床意義的干擾，樣本量過小，無論試驗(yàn)結(jié)果是否存在差異，都有可能因?yàn)殡S機(jī)誤差過大而無法得到正確的結(jié)論。近些年來，國家局發(fā)布了一系列的指導(dǎo)原則，在指導(dǎo)原則中關(guān)于樣本適用性分析中，多數(shù)要求“如產(chǎn)品聲稱的樣本類型包括血清、血漿或全血樣本，則應(yīng)對(duì)三者進(jìn)行相關(guān)性研究以確認(rèn)三者檢測(cè)結(jié)果是否完全一致或存在某種相關(guān)性（如系數(shù)關(guān)系）[5]?！比欢趯徳u(píng)過程中，發(fā)現(xiàn)部分試劑生產(chǎn)廠商在對(duì)樣本適用性分析時(shí)，僅僅做了線性相關(guān)分析，給出r值或r2值，未進(jìn)一步分析一致性，而相關(guān)系數(shù)是用于表示兩定量資料線性相關(guān)關(guān)系的密切程度，非一致性。一致性分析可采用配對(duì)檢驗(yàn)、方差分析、Bland-Altman法等對(duì)多種樣本類型的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，如無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且無臨床意義，則認(rèn)為樣本具有相同的適用性，如有差異，可嘗試進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)，是否具有恒定的偏差，即通過一定的補(bǔ)償系數(shù)來修正結(jié)果，使不同樣本之間的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，多見于全血樣本。如差異既有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義又有臨床意義，則認(rèn)為樣本不具相同的適用性。

4.小結(jié)

隨著真空采血管在臨床實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用，試劑生產(chǎn)廠家在進(jìn)行樣本適用性研究時(shí)，首先除了要考慮同源樣本類型的一致性，還應(yīng)充分考慮臨床實(shí)際應(yīng)用中所用不同采血管造成的樣本檢測(cè)一致性問題，而添加劑又是決定真空采血管性能至關(guān)重要的因素[6]。添加劑有抗凝劑、促凝劑和分離膠，不但要關(guān)注抗凝劑對(duì)樣本的影響，同樣應(yīng)關(guān)注促凝劑、分離膠及實(shí)際臨床應(yīng)用的不同采血管對(duì)樣本的影響。其次進(jìn)行樣本比對(duì)時(shí)，應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行驗(yàn)證樣本之間、不同采血管之間等所有適用樣本類型及條件的一致性，除了給出線性相關(guān)系數(shù)外，更應(yīng)進(jìn)一步對(duì)差異及一致性進(jìn)行充分驗(yàn)證。本文針對(duì)樣本適用性在審評(píng)過程中遇到的一些問題的以上總結(jié)，希望對(duì)企業(yè)和審評(píng)員在研究和審評(píng)過程中有所幫助。