HBV感染者肝細(xì)胞樣本的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路的生物信息學(xué)挖掘

李林芝，謝 君，朱乃碩

(遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院),上海 200438)

乙肝病毒(HBV)感染是一個(gè)在全球范圍危害公眾健康的問題[1]。全球約有20億人感染過乙肝病毒，超過3.5億慢性乙肝攜帶者[2]。其中大約有15%～40%的乙肝患者會(huì)發(fā)展成肝硬化、肝功能衰竭或肝細(xì)胞癌[3]。每年大約有50～120萬人因乙肝死亡[4-5]，感染乙肝病毒已成為全球第十大死因[6]。感染乙肝病毒使肝細(xì)胞癌的發(fā)病率增加[7]，每年約有30～50萬人因感染乙肝病毒罹患肝細(xì)胞癌，肝細(xì)胞癌已成為常見的癌癥[8]，是全球癌癥死亡的第二大原因[9]。全球人口大約有45%居住在HBV高發(fā)地區(qū)[10-11]。

隨著高通量平臺(tái)大量應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，生物芯片成為臨床樣本病理分析的有效工具，可以快速、高效、精確、低成本地進(jìn)行信號(hào)通路探索、疾病預(yù)測(cè)分子診斷、新藥靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、腫瘤反應(yīng)預(yù)測(cè)等工作[12-13]，本研究便采取了芯片分析的方法來探索乙肝感染造成的基因表達(dá)和信號(hào)通路的改變，從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo /)下載了基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE83148后對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后篩選出fold change≥2，p-value<0.05的差異表達(dá)基因，接著對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO和KEGG富集分析和GeneMANIA(http://genemania.org/)基因網(wǎng)絡(luò)互作分析，發(fā)現(xiàn)了一些HBV感染細(xì)胞后的關(guān)鍵基因和信號(hào)通路，這對(duì)我們研究HBV 感染發(fā)病以及癌變的具體機(jī)制有一定意義。

1 材料和方法

1.1 材料

芯片數(shù)據(jù)集GSE83148從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo /)下載，pHBV1.3質(zhì)粒，pcDNA3.1質(zhì)粒，hepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室自有，RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，PCR生化反應(yīng)試劑購自寶生物工程(大連)有限公司，引物由華津生物科技有限公司合成，veriti96-well thermal cycler PCR儀購置于Applied Biosystems公司，5424型高速離心機(jī)購置于eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 獲得差異表達(dá)基因

GSE83148基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集由美國Affymetrix公司制作，基于GPL570平臺(tái)。GSE83148包含122個(gè)HBV感染者的肝細(xì)胞樣本和6個(gè)健康對(duì)照肝細(xì)胞樣本。下載CEL格式的原始數(shù)據(jù)，使用R語言做質(zhì)量檢測(cè)后將質(zhì)量合格的芯片做數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，然后用經(jīng)典t檢驗(yàn)篩選出fold change≥2，p-value<0.05的差異表達(dá)基因。

1.2.2 差異表達(dá)基因的GO分析和KEGG分析

將篩選獲得的差異表達(dá)基因上傳到DAVID生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)，進(jìn)行GO分析和KEGG分析，找出差異表達(dá)基因的分子功能、細(xì)胞組成、生物過程和富集的KEGG信號(hào)通路。

1.2.3差異表達(dá)基因互作網(wǎng)絡(luò)分析

將獲得的差異表達(dá)基因上傳到GeneMANIA(http://genemania.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因網(wǎng)絡(luò)互作分析，選擇合適的”network”和”function”，獲得差異表達(dá)基因間的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系和樞紐基因圖。

1.2.4 Real-time PCR驗(yàn)證上述預(yù)測(cè)結(jié)果

(1)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。復(fù)蘇HepG2細(xì)胞，傳代3次后，布6孔板，待細(xì)胞有60%融合度時(shí)，實(shí)驗(yàn)組每孔轉(zhuǎn)染4 μg乙肝病毒1.3倍體質(zhì)粒pHBV1.3，對(duì)照組轉(zhuǎn)染4 μg空載pcDNA3.1質(zhì)粒，48 h后收集樣品。

(2)總RNA提取。收取樣品后，進(jìn)行RNA的提取。收集樣品時(shí)，棄去細(xì)胞孔中的培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，各1～2 min。然后向每個(gè)細(xì)胞孔中添加400 μL Trizol試劑，室溫放置2～3 min后，充分吹打以保證細(xì)胞從孔壁上完全脫落，然后將液體收集于 RNase free的EP管中。

提取RNA的步驟如下：①將上述EP管放在混勻器上劇烈振蕩20 s，然后室溫靜置15 min；②向每個(gè)EP管內(nèi)加入80 μL氯仿，置于混勻器劇烈振蕩2 s，室溫放置5 min后，12 000 r/min離心15 min。離心后取上層的水相到另一個(gè)RNase free的EP管內(nèi)，然后加等量異丙醇，混合均勻，-20 ℃放置30 min以上；③在4 ℃，12 000 r/min離心15 min，棄去上清，向EP管內(nèi)加入300 μL 75%的無水乙醇，洗滌沉淀，然后4 ℃，12 000 r/min離心5 min。棄去上清，將EP管蓋子打開，置于超凈臺(tái)中，直到沉淀被吹至透明后，向每個(gè)EP管內(nèi)加入20 μL RNase free水。

(3)反轉(zhuǎn)錄。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)提供的說明書獲得cDNA。步驟簡述如下：在10 μL體系中，5X PrimScript RT Master Mix 2 μL，total RNA 4 μL，RNase free 水4 μL。反應(yīng)體系中，RNA的用量最大為500 ng。將反應(yīng)體系設(shè)置為37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。

(4)引物的設(shè)計(jì)和合成。根據(jù)GenBank公布的全基因序列作為設(shè)計(jì)引物的參考序列，用Primer Premier 5設(shè)計(jì)，引物合成由上海華津生物科技有限公司完成。目的和內(nèi)參引物序列見表1。

Real-time PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s，62 ℃ 31 s，一共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。結(jié)果用β-actin做為內(nèi)參，用2-△△ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 基因引物列表Table 1 List of gene primers

2 結(jié)果分析

2.1 獲得差異表達(dá)基因

下載GSE83148數(shù)據(jù)集(CEL格式)，芯片信息如表2。

對(duì)樣品芯片進(jìn)行灰度掃描、RNA降解分析、以及用simpleaffy包進(jìn)行分析后，表明芯片制作的技術(shù)誤差在允許范圍內(nèi)，因此將122張HBV樣本和6張對(duì)照樣本全部納入分析，圖1為122張HBV芯片和6張對(duì)照組芯片灰度掃描箱線圖。

表2 芯片GSE83148的基本信息Table 2 Basic information of chip GSE83148

圖1 芯片灰度掃描箱線圖Fig.1 Chip grayscale scanning box plot

從芯片中提取基因數(shù)據(jù)37 707個(gè)，用RMA法進(jìn)行背景校正，中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后，篩選出HBV組相較于對(duì)照組fold change≥2，p-value<0.05的上調(diào)表達(dá)基因44個(gè)(見表3)。

表3 fold change≥2，p-value<0.05的上調(diào)基因Table 3 Up-regulated genes with fold change≥2, p-value<0.05

2.2 GO富集分析

對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分析(見表4)。GO分析結(jié)果表明，HBV感染的肝細(xì)胞上調(diào)的差異表達(dá)基因主要富集的細(xì)胞過程有：對(duì)伽瑪輻射的反應(yīng)，蛋白質(zhì)四聚化，細(xì)胞對(duì)紫外線反應(yīng)，對(duì)藥物反應(yīng)；主要富集的細(xì)胞代謝區(qū)域?yàn)榫€粒體。BAK1基因和TP63基因被富集入多條信號(hào)通路。BAK1基因編碼的蛋白屬于BCL2蛋白家族,BCL2家族成員形成寡聚體或異二聚體并且充當(dāng)涉及各種細(xì)胞活性的抗凋亡或促凋亡調(diào)節(jié)劑,這種蛋白定位于線粒體，并起到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,它與線粒體電壓依賴性陰離子通道的開放相互作用并加速其開放，這導(dǎo)致膜電位的喪失和細(xì)胞色素c的釋放,暴露于細(xì)胞應(yīng)激后，該蛋白還與腫瘤抑制因子P53相互作用[14]。TP63基因編碼的蛋白是p53家族轉(zhuǎn)錄因子的成員[15]，與NF-KB信號(hào)通路相互作用[16]。

2.3 KEGG通路分析

將上述獲得的差異表達(dá)基因做KEGG通路富集(見表5)，未獲得富集基因的信號(hào)通路。將篩選條件放寬至fold change≥1.5,p-value<0.05后獲得差異表達(dá)基因富集KEGG信號(hào)通路，獲得的信號(hào)通路有：乙型肝炎信號(hào)通路、病毒癌變信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路。FoxO信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期控制，葡萄糖代謝，氧化應(yīng)激抗性等方面有著重要作用[17]，F(xiàn)oxO信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)制是響應(yīng)于胰島素以及幾種生長因子，通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)下游的絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt /蛋白激酶B(Akt / PKB)磷酸化，三個(gè)保守殘基磷酸化導(dǎo)致FoxO蛋白從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，從而降低FoxO靶基因的表達(dá)。而應(yīng)激激活的c-Jun N端激酶(JNK)和能量感應(yīng)AMP激活蛋白激酶(AMPK)在氧化和應(yīng)激刺激下磷酸化并激活FoxO。 除了PKB，JNK和AMPK之外，F(xiàn)oxO還受到多個(gè)參與者的調(diào)控，包括磷酸化，乙酰化，甲基化和泛素化等。磷脂酰肌醇3’-激酶(PI3K)-Akt信號(hào)通路可被多種類型的細(xì)胞刺激或毒性損傷激活，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，翻譯，增殖，生長和存活等基本的細(xì)胞功能。生長因子與其受體酪氨酸激酶(RTK)或G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的結(jié)合分別刺激PI3K的Ia和Ib亞型。 PI3K催化細(xì)胞膜上磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)的產(chǎn)生。第二信使PIP3激活A(yù)kt， 激活后Akt通過磷酸化參與凋亡，蛋白質(zhì)合成，代謝和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等過程。

表4 差異表達(dá)基因的GO分析Table 4 GO analysis of differentially expressed genes

表5 差異表達(dá)基因的KEGG分析Table 5 KEGG analysis of differentially expressed genes

2.4 基因互作網(wǎng)絡(luò)分析

差異表達(dá)基因生成的互作網(wǎng)絡(luò)圖如圖2所示：BAK1、GNG5、ATP5B、NDUFS1、NDUFS2、IMMT、MLX、OPA1等9個(gè)基因被富集，這些基因均與線粒體氧化呼吸鏈有關(guān)，基因NDUFS1、NDUFS2、ATP5B、COX7B、OPA1處于互作網(wǎng)絡(luò)中的核心位置。

NDUFS1、NDUFS2是線粒體呼吸鏈復(fù)合體1的核心基因，復(fù)合體1是線粒體內(nèi)膜上最大的蛋白質(zhì)復(fù)合物，催化NADH氧化，既是電子傳遞體又是質(zhì)子傳遞體。呼吸作用會(huì)產(chǎn)生活性氧，活性氧化學(xué)性質(zhì)活潑，既是電子供體又是電子受體，是生命活動(dòng)中不可缺失的活性物質(zhì)，可以提高某些酶的活性，如肝臟中一些合成酶和解毒酶，分析結(jié)果顯示與NDUFS1基因共表達(dá)的基因有NDUFS2,ATP5B,IMMT,MLX,PRELID3B,CAST,TFRC,GNG5，COX7B,GRSF1，METAP1，NCKAP1，PGK1,共定位的基因有COX7B和NDUFS2;與NDUFS2共表達(dá)的基因有NDUFS1，OPA1，GSS,ATP5B,BAK1，METAP1，MTRF1L,COX7B,G3BP2，ALAS1，MLX,CTNNA1，SPTLC2，TFRC,PRELID3B,RBM5，CLCN4，LDHA,IMMT,MRTTL2A,GRSF1，共定位的基因有NDUFS1和COX7B。COX7B編碼細(xì)胞色素c氧化酶的一個(gè)的結(jié)構(gòu)亞基，線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV的重要組成部分，是線粒體呼吸不可缺失的部分[18]，本研究篩選出的差異表達(dá)基因中與COX7B共表達(dá)的基因有IMMT,NDUFS1，NDUFS2，ATP5B,PGK1，ALAS1，GNG5，KRT10，CAST, 與COX7B共定位的基因有ATP5B，PGK1，GRSF1，AK1。ATP5B編碼ATP合酶的Fl部分的β亞基，β亞基是ATP 酶氧化磷酸化合成ATP的限速組分，它是ATP酶復(fù)合體中唯一的一個(gè)催化亞單位[19]，篩選的差異表達(dá)基因中與ATP5B共表達(dá)的基因有NDUFS1，NDUFS2，MGST1，IMMT,GRSF1，VAV2，MTRF1L,METAP1，ALAS1，MLX,CTNNA1，SPTLC2，PRELID3B,TFRC,共定位的基因有COX7B,SPTLC2，KRT10，GRSF1，AK1。OPA1位于線粒體內(nèi)膜，參與線粒體嵴重塑，阻止細(xì)胞色素C釋放，是調(diào)節(jié)線粒體分裂與融合的關(guān)鍵基因[20]，與OPA1共表達(dá)的基因有CAST,CDYL,G3BP2，ANKRD17，NDUFS2，ZFC3H1，NCKAP1。這些表達(dá)上調(diào)說明HBV感染后肝細(xì)胞氧化還原反應(yīng)活躍。

圖2 GeneMANIA網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 GeneMANIA network diagram

注：彩圖見電子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.2018年第4期)。

2.5 Real-time PCR驗(yàn)證芯片分析結(jié)果

如圖3所示，X軸表示基因名稱，Y軸表示基因表達(dá)量之比，HepG2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染乙肝病毒1.3倍體質(zhì)粒48h后，BAK1、TP63、NDUFS1、NDUFS2、COX7B、ATP5B、OPA1的mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P <0.05)，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖3 Real-time PCR驗(yàn)證芯片分析結(jié)果Fig.3 Real-time PCR verification chip analysis results

注：圖中結(jié)果以β-actin為內(nèi)參，用2-△△ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析，轉(zhuǎn)乙肝病毒1.3倍體質(zhì)粒組中BAK1、TP63、NDUFS1、NDUFS2、COX7B、ATP5B、OPA1mRNA表達(dá)水平，與正常對(duì)照相比, *P<0.05 (n=3).

3 討 論

本研究從GSE83148基因表達(dá)譜中獲得37 707個(gè)基因，從這37 707個(gè)基因中獲得HBV組fold change≥2，px-value<0.05的差異表達(dá)基因44個(gè)，對(duì)這44個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因做了一系列分析后獲得7個(gè)關(guān)鍵基因，BAK1，TP63，NDUFS1，NDUFS2，COX7B，ATP5B，OPA1，這些基因均與線粒體以及氧化呼吸鏈相關(guān)，提示患者感染乙肝病毒后線粒體氧化還原反應(yīng)活躍。氧化還原活躍后會(huì)產(chǎn)生更多的活性氧,已有研究表明感染乙肝病毒后會(huì)，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量活性氧，活性氧增多導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)(Oxidative stress)造成細(xì)胞損傷，這一損傷參與多種病理機(jī)制[21]。線粒體靶向抗氧化劑可以顯著改善HBV感染后的線粒體和抗病毒CD8T功能[22]。但HBV感染后如何造成這些基因表達(dá)量增高的具體原因尚不明了，仍需進(jìn)一步探索研究。本研究發(fā)現(xiàn)HBV感染者差異表達(dá)基因富集的信號(hào)通路有：乙型肝炎信號(hào)通路、病毒癌變信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路。FoxO信號(hào)通路響應(yīng)于胰島素以及幾種生長因子，通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)下游的絲氨酸-蘇氨酸激酶Akt /蛋白激酶B(Akt / PKB)磷酸化，在細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期控制，葡萄糖代謝，氧化應(yīng)激抗性等方面有著重要作用，且與PI3K-Akt信號(hào)通路聯(lián)系緊密。篩選出的關(guān)鍵基因和富集的信號(hào)通路均與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)，表明HBV感染后的氧化損傷可能是造成感染者肝細(xì)胞損傷及細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因素，但具體機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步探究。