液相色譜法測(cè)定筋骨草膠囊特征圖譜研究

聶萬(wàn)松，汪艷，占曉敏，王云龍，竇瑋，汪波

筋骨草膠囊為筋骨草(白毛夏枯草)經(jīng)加工制成的膠囊劑，具有清熱解毒，止咳，祛痰，平喘。用于急、慢性支氣管炎、肺膿瘍[1 ]。原標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)特征圖譜進(jìn)行檢測(cè)。為提高本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本論文通過(guò)研究建立其特征圖譜，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制。本法專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便，可作為本藥的質(zhì)量控制方法之一。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Agilent 1260)，電子分析天平(島津AUW120D十萬(wàn)分之一)；木犀草素(111520-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；乙腈、甲醇為色譜純，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司生產(chǎn)；乙醇為色譜純，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)；水為超純水，其余試劑均為分析純。筋骨草膠囊(黃山市天目藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)161001、170301、170302、170303)。

2 方法與結(jié)果

本研究起止時(shí)間為2016年2月至2017年5月。

2.1色譜條件色譜柱：Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈為流動(dòng)相A，0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按木犀草素峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，其余分離度應(yīng)符合規(guī)定。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取木犀草素對(duì)照品用乙醇配制成1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入乙醇25 mL，精密稱定重量，加熱回流30 min，放冷，稱重，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性供試品溶液制備 按筋骨草膠囊成品制劑方法制得缺筋骨草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性供試品溶液。

2.3專屬性試驗(yàn)分別用“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”節(jié)的溶液進(jìn)樣，按“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖的出峰時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖1～4。

木犀草素對(duì)照品峰(圖1)與筋骨草膠囊中木犀草素峰(圖2)的保留時(shí)間一致。供試品特征圖譜(圖2)中有多個(gè)峰出現(xiàn)，選取基線分離清晰的峰為特征峰：木犀草素對(duì)照品峰(峰1)、隨后出現(xiàn)了2個(gè)較為明顯的特征峰(峰2、峰3)。選定：在供試品特征圖譜中的3個(gè)特征峰中(圖4)，與木犀草素參照物峰相對(duì)應(yīng)的峰設(shè)置為峰1(S)，計(jì)算峰2、3與S峰的相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果：峰2～3與峰1(S)的相對(duì)保留時(shí)間為1.218(峰2)、1.794(峰3)。見(jiàn)表2。

圖1 木犀草素對(duì)照品溶液高效液相色譜圖

圖2 筋骨草膠囊供試品溶液高效液相色譜圖

圖3 缺筋骨草陰性供試品溶液高效液相色譜圖

注：峰1(S)：木犀草素圖4 對(duì)照特征圖譜

組別木犀草素峰位置/min其他峰位置/min特征圖譜比值陰性樣品無(wú)無(wú)木犀草素對(duì)照品溶液14無(wú)筋骨草膠囊16100114.27417.395、25.6121.218、1.794

陰性樣品溶液在相應(yīng)位置處無(wú)相應(yīng)的峰出現(xiàn)，對(duì)木犀草素等3個(gè)峰無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

初步定為：峰2～3與峰1(S)的相對(duì)保留時(shí)間為：1.218(峰2)、1.794(峰3)。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)分別稱取筋骨草膠囊(批號(hào)：161001)樣品按“2.2.2”節(jié)方法制備6份供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，在供試品特征圖譜(見(jiàn)圖2)中選定的3個(gè)特征峰中，與木犀草素參照物峰相對(duì)應(yīng)的峰1(S)，計(jì)算峰2、3與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果峰2～3與峰1(S)的相對(duì)保留時(shí)間為：1.217(峰2)、1.79(峰3)，其相對(duì)保留時(shí)間在規(guī)定值[1.218(峰2)、1.794(峰3)]的±5%之內(nèi)，表明此特征圖譜測(cè)定方法重現(xiàn)性良好。見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)情況

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取筋骨草膠囊(批號(hào)：161001)按供試品溶液的制備方法制備，按上述色譜條件于0、2、4、8、12、15、19、24h進(jìn)樣測(cè)定相對(duì)保留時(shí)間，RSD=0%，與標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)保留時(shí)間相比，相差少于±5%。結(jié)果表明樣品溶液在24h內(nèi)特征圖譜穩(wěn)定。相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)情況

2.6筋骨草膠囊樣品測(cè)定取筋骨草膠囊按供試品溶液的制備方法制備，按“2.1”節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定各峰保留時(shí)間。結(jié)果：各批號(hào)產(chǎn)品特征圖譜相對(duì)保留時(shí)間平均為：1.220(峰2)、1.801(峰3)在規(guī)定值[1.218(峰2)、1.794(峰3)]的±5%之內(nèi)。見(jiàn)表5。

表5 特征圖譜測(cè)定結(jié)果表

2.7耐用性

2.7.1不同色譜柱 本實(shí)驗(yàn)分別使用了Kromasil100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)及Welch xtimateC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)兩種不同的色譜柱，并分別在安捷倫1260型高效液相色譜儀及Thermo高效液相色譜儀上測(cè)定，結(jié)果無(wú)明顯差異。使用Kromasil100-5C18柱測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，使用Welch xtimateC18柱測(cè)定結(jié)果表明：不同色譜柱影響不大。見(jiàn)表7。

2.7.2柱溫 經(jīng)分別按柱溫25 ℃、30 ℃方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，對(duì)其液相色譜圖及數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明柱溫對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響：SD為0.028%(<2%)，在合格要求內(nèi)。見(jiàn)表8。

3 討論

3.1實(shí)驗(yàn)色譜條件選擇[2-7]，木犀草素對(duì)照品溶液經(jīng)光譜掃描，在350 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選定350 nm為檢測(cè)波長(zhǎng);流動(dòng)相曾采用乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液等不同的系統(tǒng)，嘗試了不同的流動(dòng)相比例，結(jié)果以本文采用的乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脫，分離效果好。供試品溶液的制備[2-7]，比較了超聲處理和回流提取，提取時(shí)間以及提取溶劑，最后確定本文方法提取供試品完全，且分離效果好。

表6 Kromasil100-5C18柱特征圖譜測(cè)定結(jié)果

表7 Welch xtimateC18柱特征圖譜測(cè)定結(jié)果

表8 柱溫對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響

3.2參照藥典及不同文獻(xiàn)測(cè)定筋骨草膠囊乙酰哈巴苷含量[8-10 ]，但因產(chǎn)品生產(chǎn)工藝原因，乙酰哈巴苷轉(zhuǎn)移率較低，不符合要求。

3.3筋骨草膠囊的特征圖譜具有鑒別不同種的筋骨草的作用經(jīng)多次測(cè)定，筋骨草膠囊與筋骨草的特征圖譜具有一致性。我公司2017年1月份同時(shí)分別從四川、浙江及湖北采購(gòu)來(lái)的均稱為筋骨草藥材，經(jīng)檢定四川產(chǎn)的“筋骨草”為散瘀草(Ajuga pantantha Hand.-Mazz)，浙江及湖北的“筋骨草”為正品筋骨草(Ajuga decumbens Thunb.)，散瘀草與筋骨草兩者從外觀區(qū)分極為相似，且按藥典檢測(cè)均含有乙酰哈巴苷。但從特征圖譜進(jìn)行比較，能正確判斷筋骨草正品與偽品的區(qū)別。

4 結(jié)論

筋骨草膠囊在液相色譜圖中，供試品圖譜3個(gè)特征峰，對(duì)其進(jìn)行相對(duì)保留時(shí)間檢測(cè)，快捷、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確。