異甘草酸鎂注射液聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株凋亡及其機(jī)制

徐君南，李美靜，李曉睿，高志超，孫濤

乳腺癌是引起全世界范圍內(nèi)女性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。近年來(lái)，大量治療乳腺癌的化療、內(nèi)分泌和靶向藥物問(wèn)世，顯著改善乳腺癌病人的生存預(yù)后。然而不幸的是絕大多數(shù)乳腺癌的病人最終往往對(duì)化療藥物耐受，從而導(dǎo)致治療失敗甚至死亡[1]。化療仍是乳腺癌治療的基石，如何提高化療藥物的抗腫瘤作用是臨床醫(yī)師的研究重點(diǎn)。紫杉醇是繼蒽環(huán)類藥物之后為乳腺癌病人治療的基石化療藥物，但體外研究表明藥物外排蛋白高表達(dá)或者乳腺癌干細(xì)胞等均可導(dǎo)致紫杉醇耐藥[2-3]。異甘草酸鎂(magnesium isoglycyrrhizinate，MGL)作為甘草酸的一種立體異構(gòu)體，主要由天然甘草提取并堿化后制成鎂鹽形式，其生物學(xué)活性包括抗炎、肝保護(hù)、抗氧化和抗病毒等[4]。少部分臨床前及臨床研究表明異甘草酸鎂有一定抗腫瘤活性[5]，然而其對(duì)于乳腺癌細(xì)胞的影響及確切的作用機(jī)制尚不明確。本研究基于此，研究異甘草酸鎂單藥及聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡作用，并探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料本研究于遼寧省乳腺癌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自2016年3月至2017年1月進(jìn)行，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))。異甘草酸鎂注射液(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)160115104)，紫杉醇(百時(shí)美施貴寶有限公司，生產(chǎn)批號(hào)3L01986)由提供。β-actin抗體、pBcl-2單抗、Notch2單抗、Caspase-3多抗均購(gòu)自于Abcam公司和CST公司。辣根過(guò)氧化物酶-結(jié)合抗兔的二抗、CCK-8試劑盒和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液購(gòu)自于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)于BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7置于含10%胎牛血清、l×108U/L青霉素、100 g/L鏈霉素的DMEM(高糖型)培養(yǎng)基中。調(diào)整細(xì)胞密度為105/mL置于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2的恒溫細(xì)胞孵育箱中連續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8法測(cè)細(xì)胞抑制 將細(xì)胞密度為5×104/mL-1MCF-7細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度的異甘草酸鎂注射液(0、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1 000) μmol/L和10 μmol/L紫杉醇培養(yǎng)48 h，其加入CCK8反應(yīng)液10 μL，4 h后在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為490 mm處測(cè)定各孔的光吸收值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)至少3次。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率 設(shè)定陰性空白對(duì)照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組、異甘草酸鎂注射液聯(lián)合紫杉醇(聯(lián)合)組四組，細(xì)胞24 h后收集，并加500 μL結(jié)合緩沖液再加5 μL 磷脂酰絲氨酸蛋白抗體(AnnexinV-FITC) 和5 μL 碘化丙啶(Propidium iodide，PI)試劑分別混合，室溫反應(yīng)15 min。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定不同組別的細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡情況。

1.2.4蛋白印跡法(Western Blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)設(shè)定陰性空白對(duì)照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組、異甘草酸鎂注射液聯(lián)合紫杉醇組四組，收集藥物處理24 h的蛋白，提取總蛋白并測(cè)定其濃度，采用Western Blot分別檢測(cè)β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、磷酸化B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(phosphate-B-cell lymphoma-2，pBcl-2)、半胱天冬酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3以及缺口蛋白(Notch)通路Notch2蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1異甘草酸鎂注射液、紫杉醇對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外增殖抑制作用CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示：濃度在0.1～100 μmol/L之間的異甘草酸鎂注射液對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)，之后略有下降，在100 μmol/L達(dá)到最高峰，詳見(jiàn)圖1。不同濃度的異甘草酸鎂注射液聯(lián)合紫杉醇的CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示：與單藥組對(duì)比，兩藥聯(lián)合組有較高的細(xì)胞增殖抑制率，尤其在100 μmol/L(60.89% 比 26.98%，t=-0.017，P<0.05)，兩藥相互作用指數(shù)q值分別為1.987，顯示異甘草酸鎂注射液聯(lián)合紫杉醇對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制具有一定協(xié)同作用。

圖1 不同濃度異甘草酸鎂注射液及聯(lián)合紫杉醇干預(yù)MCF-7細(xì)胞增殖抑制情況

2.2異甘草酸鎂注射液聯(lián)合紫杉醇促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：空白對(duì)照組，100 μmol/L異甘草酸鎂、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L異甘草酸鎂聯(lián)合10 μmol/L紫杉醇聯(lián)合組與MCF-7細(xì)胞的早期凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=209.839，P<0.001)，且與空白對(duì)照組相比，100 μmol/L異甘草酸鎂、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L異甘草酸鎂聯(lián)合10 μmol/L紫杉醇聯(lián)合組的早期凋亡率更高(均P<0.001)?？瞻讓?duì)照組，100 μmol/L異甘草酸鎂、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L異甘草酸鎂聯(lián)合10 μmol/L紫杉醇聯(lián)合組與MCF-7細(xì)胞的晚期凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.742，P<0.001)。與單藥組相比，100 μmol/L異甘草酸鎂、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L異甘草酸鎂聯(lián)合10 μmol/L紫杉醇聯(lián)合組顯著增加MCF-7細(xì)胞的晚期凋亡率(均P<0.001)。見(jiàn)表1和圖2。

表1 異甘草酸鎂注射液、紫杉醇及聯(lián)合干預(yù)MCF-7細(xì)胞24 h的凋亡情況/(%，±s)

圖2 異甘草酸鎂注射液、紫杉醇及聯(lián)合組干預(yù)MCF-7細(xì)胞24 h的細(xì)胞流式圖

圖3 異甘草酸鎂注射液、紫杉醇及聯(lián)合組干預(yù)MCF-7細(xì)胞pBcl-2、Caspase-3和Notch2表達(dá)：A為pBcl-2、caspase-3和b-actin的Western Blot代表性條帶；B為Notch-2和b-actin的Western Blot代表性條帶；C為pBcl-2、caspase-3和b-actin的條帶灰度值比值匯總圖；D為Notch-2和b-actin條帶灰度值比值的匯總圖

2.3異甘草酸鎂注射液聯(lián)合紫杉醇增加MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)空白對(duì)照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組及聯(lián)合組分別干預(yù)MCF-7細(xì)胞后，凋亡相關(guān)蛋白pBcl-2在空白對(duì)照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組和聯(lián)合組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.064，P<0.001)，聯(lián)合組的pBcl-2蛋白表達(dá)均高于其他三組(1.94，0.79，0.83和1.01，均P<0.001)。Caspase-3蛋白表達(dá)在空白對(duì)照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組和聯(lián)合組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.287，P=0.11)；Notch2蛋白表達(dá)在空白對(duì)照組、異甘草酸鎂注射液組、紫杉醇組和聯(lián)合組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.849，P=0.063)。異甘草酸鎂注射液與紫杉醇聯(lián)合組的Caspase-3蛋白表達(dá)高于空白對(duì)照組、異甘草酸鎂注射液組(3.17 比 2.01，P=0.027；3.17 比 2.13，P=0.046)，而與紫杉醇單藥組相當(dāng)(3.17 比 2.46，P=0.160)。聯(lián)合組的Notch2蛋白表達(dá)與紫杉醇單藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.17 比 0.82，P=0.121)，高于空白對(duì)照組、異甘草酸鎂注射液組(1.17 比 0.67，P=0.018；1.17 比 0.69，P=0.022)。詳見(jiàn)圖3。

3 討論

化療是乳腺癌綜合治療的基石，紫杉醇是繼蒽環(huán)類藥物之后為乳腺癌病人治療的化療藥物，但體外研究表明藥物外排蛋白高表達(dá)或者乳腺癌干細(xì)胞等均可導(dǎo)致紫杉醇耐藥[2-3]。異甘草酸鎂作為甘草酸的一種立體異構(gòu)體，主要由天然甘草提取并堿化后制成鎂鹽形式，其生物學(xué)活性包括抗炎、肝保護(hù)、抗氧化和抗病毒等[4]。少部分臨床前及臨床研究表明異甘草酸鎂有一定抗腫瘤活性[5-6]。Arase等[7]在慢性丙肝病人進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)甘草酸預(yù)處理的長(zhǎng)期觀察，長(zhǎng)時(shí)間服用(甘草酸2～16年)、短期服用(<2年)和未服用者，肝癌的發(fā)生率分別是7%、12%和25%，可見(jiàn)甘草酸具有抗腫瘤的作用，但需要長(zhǎng)期服用。其分子機(jī)制探討中主要活性成分甘草次酸修復(fù)強(qiáng)致癌劑苯丙芘誘導(dǎo)的DNA損傷，以及抑制鳥(niǎo)氨酸脫羧酶激活作用。此外，甘草酸在子宮內(nèi)膜癌、胃癌KATOⅢ細(xì)胞和白血病原髓細(xì)胞表現(xiàn)出抑制增殖作用[8]。然而，目前對(duì)于甘草酸在抗癌領(lǐng)域的研究也只是處于一個(gè)起步的階段，異甘草酸鎂單藥及聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7凋亡及作用機(jī)制等尚不清楚，仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)探討。我們研究結(jié)果顯示濃度在0.1～100 μmol/L之間的異甘草酸鎂注射液對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)，之后略有下降，在100 μmol/L達(dá)到最高峰。100 μmol/L異甘草酸鎂聯(lián)合10 μmol/L紫杉醇聯(lián)合組顯著增加MCF-7細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率。

異甘草酸鎂促進(jìn)紫杉醇凋亡的機(jī)制探討發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組的pBcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)均高于其他三組(P<0.05)；Bcl-2是抗凋亡蛋白，pBcl2為磷酸化Bcl2狀態(tài)，喪失了對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，造成線粒體等細(xì)胞器的功能喪失和細(xì)胞器內(nèi)促凋亡因子的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。聯(lián)合組和紫杉醇組的Notch2蛋白表達(dá)相較于均增加空白對(duì)照組和異甘草酸鎂注射液?jiǎn)嗡幗M。Notch信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡。研究表明，乳腺癌細(xì)胞與乳腺癌干細(xì)胞中存在Notch信號(hào)途徑的異?；罨痆9-10]，并且這種異?；罨c內(nèi)分泌及曲妥珠單抗治療耐受相關(guān)[11-12]。因此，靶定Notch信號(hào)途徑可能是一種治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的新策略。γ-分泌酶抑制劑(γ secretase inhibitors)可以阻斷Notch信號(hào)途徑活化所必須的細(xì)胞內(nèi)溶蛋白性裂解過(guò)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞增殖[13-15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇單藥與Notch2活化相關(guān)，本研究進(jìn)一步證實(shí)異甘草酸鎂能增強(qiáng)紫杉醇的促凋亡作用，與Notch2活化仍有關(guān)。

總之，異甘草酸鎂注射液協(xié)同促進(jìn)紫杉醇誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞(MCF-7細(xì)胞株)凋亡，其機(jī)制可能與促進(jìn)紫杉醇通過(guò)Notch通路上調(diào)MCF-7細(xì)胞pBcl-2、Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)，本研究為臨床上增效紫杉醇抗腫瘤作用提供了理論依據(jù)。