解脂耶氏酵母產(chǎn)脂肪酶的研究進展

張付濤，陳凱麗，王東月，劉雪瑩，李運清*

（1.濟寧醫(yī)學院 臨床醫(yī)學院，山東 濟寧 272067；2.濟寧醫(yī)學院 病原生物學教研室，山東 濟寧 272067）

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一種非常規(guī)酵母，在進化上與常規(guī)酵母——釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相距較遠，有其獨特的生理生化及新陳代謝活性。近年來隨著該物種基因組測序的完成，基因擴增系統(tǒng)的建立，越來越多的科學家開始了對解脂耶氏酵母的研究，并解決了眾多的生物學問題。由于解脂耶氏酵母易培養(yǎng)，可利用的底物范圍也非常廣泛，使得該酵母在工業(yè)中的應(yīng)用越來越廣泛。本文主要對解脂耶氏酵母產(chǎn)生的脂肪酶的特點、脂肪酶編碼基因及其產(chǎn)生的脂肪酶的應(yīng)用等方面進行綜述，讓更多研究者了解到解脂耶氏酵母和脂肪酶基因的新進展以及為他們提供解脂耶氏酵母研究的新思路，同時為研究出更多提高脂肪酶活性和高效批量生產(chǎn)脂肪酶的新方法提供依據(jù)，進一步為解脂耶氏酵母脂肪酶的更多應(yīng)用做鋪墊。

1 解脂耶氏酵母與脂肪酶

解脂耶氏酵母是非傳統(tǒng)的酵母物種之一，屬于半子囊菌綱、耶氏酵母菌屬。該酵母能利用多種疏水性底物為唯一碳源進行生長繁殖，并且可以利用眾多廉價底物分泌產(chǎn)生多種代謝物，被美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）認定為一般認為安全（generallyregarded as safe，GRAS）的微生物。解脂耶氏酵母分布非常廣泛，抗逆性極強，可以耐受高鹽及低溫，在海邊油田等極端環(huán)境中均可分離得到[1-2]。隨著基因組測序的完成，該酵母因其獨特的生理生化、新陳代謝特點逐漸引起廣大研究者的興趣。

解脂耶氏酵母在富含脂質(zhì)的培養(yǎng)基上可以形成明顯的水解圈，這表明它可以分泌產(chǎn)生大量的脂肪酶，具有很強的分解脂肪的能力。脂肪酶能夠逐步的將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，歸屬于羧基酯水解酶類，存在于含有脂肪的動植物及微生物體內(nèi)，如霉菌以及細菌等。本質(zhì)為絲氨酸水解酶，具有多種催化能力，它能將三酰甘油酯分解為脂肪酸、二酰甘油脂、單酸甘油酯及甘油[3-4]。BRADY L等[5]通過X射線衍射法首次得到了脂肪酶的三維立體結(jié)構(gòu)，它的活性中心是一個絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸催化三連體。三連體活性中心位于脂肪酶內(nèi)部，相對疏水的氨基酸殘基形成一個螺旋狀的“蓋子”將其覆蓋，當脂肪酶起活化作用時，這個“蓋子”就會打開，此時活性中心就可以與底物結(jié)合，催化水解反應(yīng)[6]。脂肪酶可以在水油界面上起催化作用，其天然底物一般是不溶于水的長鏈脂肪酸酰基酯。由于解脂耶氏酵母來源廣泛，容易獲得并且無毒、無污染，因此，在脂肪酶的高效生產(chǎn)中逐漸被廣泛應(yīng)用。

2 解脂耶氏酵母中脂肪酶相關(guān)基因

近年來，對解脂耶氏酵母中脂肪酶相關(guān)基因的研究主要集中在基因LIP2、LIP7和LIP8，其中基因LIP2被研究的最為廣泛。解脂耶氏酵母中發(fā)現(xiàn)最早的脂肪酶相關(guān)基因是LIP2，該基因編碼的蛋白含有334個氨基酸，可以分泌到胞外，是一種胞外酶，比較容易純化獲得。研究發(fā)現(xiàn)，LIP2基因缺失后，解脂耶氏酵母仍能在以甘油三酯為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，表明LIP2基因缺失后還存在其他酯解途徑[7-9]。在與解脂耶氏酵母親緣關(guān)系較近的念珠菌屬酵母Candida deformans中，BIGEY F等[10]通過基因互補實驗，確定了CdLIP1、CdLIP2和CdLIP3均為脂肪酶相關(guān)基因，其中CdLIP1和LIP2同源性較高，為91.6%。FICHERSP等[11]利用基因CdLIP2和CdLIP3設(shè)計特定脂肪酶相關(guān)引物，在解脂耶氏酵母中擴增得到了LIP7和LIP8，它們分別編碼366和371個氨基酸，編碼產(chǎn)生的酶不能分泌到細胞外，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffersaline，PBS）清洗后容易釋放，為細胞壁結(jié)合酶。同時缺失了LIP2、LIP7和LIP8三個脂肪酶基因的突變體酵母仍然可以在三油酸甘油酯和丁酸甘油酯為唯一碳源的培養(yǎng)基上緩慢生長，但此時檢測不到胞外脂肪酶，這說明仍然存在其他脂肪酶基因或其他酯解途徑參與分解脂類化合物，但這些酶類不能被分泌到胞外。

3 脂肪酶的活性研究

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）具有多種催化能力，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、轉(zhuǎn)酯化、醇解等逆向合成反應(yīng)。脂肪酶來源不同其催化特點和效率也不一樣，其中比較有意義的脂肪酶是一種用于有機相合成的具有轉(zhuǎn)酯化功能的脂肪酶，它對于合成精細化學品有很大的幫助[12]。

解脂耶氏酵母分泌產(chǎn)生的脂肪酶Lip2作為一種具有較高應(yīng)用價值的脂肪酶具有產(chǎn)量高、易純化的優(yōu)點，但該酶熱穩(wěn)定性較差，阻礙了其在工業(yè)上的廣泛應(yīng)用。林霞[13]嘗試通過點突變技術(shù)進一步提高Lip2的熱穩(wěn)定性。成功構(gòu)建脂肪酶Lip2三個突變子T117G/C244A、F237C/C244A、T117G/F237C/C244A，并在畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115中成功表達。最終突變酶T117G/F237C/C244A的熱穩(wěn)定性最佳，在50℃條件下的半衰期＞100 min，是前期改造的Lip2突變酶（14.4 min）的熱穩(wěn)定性的7倍。由于在野生型解脂耶氏酵母中產(chǎn)生的脂肪酶活性較低，許多學者嘗試在其他微生物上表達該基因，以提高脂肪酶的產(chǎn)率。例如用α-凝集素、α-凝集素、絮凝集素Flolp等表面展示蛋白以及優(yōu)化密碼子等方式，使脂肪酶基因LIP2、LIP7、LIP8在釀酒酵母、畢赤酵母中高活性表達，以達到大量生產(chǎn)脂肪酶的目的[14-17]。

另外，脂肪酶的活性也受到底物類型和溫度、酸堿度等不同理化性質(zhì)的影響。FICKERS P等[11]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酶Lip7和Lip8的最適底物分別為己酸（C6）和癸酸（C10），發(fā)酵的最適溫度分別為40℃和45℃，最適pH值均為8.0。ZHAO HY等[18]利用畢赤酵母成功表達Lip4、Lip5脂肪酶，獲知Lip4與Lip5的最適底物均為癸酸對硝基苯酚酯，并且這兩種酶都偏好于水解中短鏈對硝基苯酚酯，最適pH值為7.0，最適溫度為40℃，二者均屬于常溫中性脂肪酶，其中脂肪酶Lip4對pH和溫度更敏感。Lip4和Lip5均能被Ca2+激活，Lip5還能被Mg2+激活；Hg2+、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）可以強烈抑制這兩種酶的活性。

超高壓技術(shù)也叫超高壓殺菌技術(shù)，是指利用100～1 000 MPa的壓力，在常溫或溫和條件下對食品加壓，以壓力作為能量因子從而影響細胞形態(tài)，改變細胞膜通透性，抑制酶的活性，造成蛋白質(zhì)不可逆變性[19]。起初超高壓技術(shù)主要用于食品保藏，后來NOEL M等[20]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓可以提高脂肪酶活性。楊新穎等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在超高壓作用下，解脂耶氏酵母脂肪酶的活性有所提高。

4 脂肪酶的生產(chǎn)研究

脂肪酶是一種具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些酯類的水解、醇解、酯類交換和逆向合成反應(yīng)等，廣泛應(yīng)用于酪成熟、廢物處理、藥物合成以及人類療法等。該酶廣泛存在于動植物和微生物中。植物脂肪酶存在于能量儲備的組織中，例如油料作物種子。動物體內(nèi)胰臟和脂肪組織中脂肪酶含量比較多，相關(guān)研究證明在微生物中脂肪酶含量更加豐富[22-24]。

目前工業(yè)上生產(chǎn)脂肪酶多采用發(fā)酵法，但對提高解脂耶氏酵母脂肪酶產(chǎn)量的發(fā)酵過程和培養(yǎng)方法研究的很少。張小琴等[25]探索了解脂耶氏酵母W29生產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵條件，分別對發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基起始pH值、搖床轉(zhuǎn)速以及發(fā)酵時間等進行了探索，研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)脂肪酶的最佳條件：發(fā)酵溫度30℃，起始pH7.0，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，接種量2.5%，培養(yǎng)時間60 h，培養(yǎng)基中橄欖油含量7.0 g/L。在此條件下，生產(chǎn)的脂肪酶酶活最高，可以達到7.7 U/mL。

由于脂肪酶生產(chǎn)成本較高，因此限制了其在工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，而高效低成本的脂肪酶的需求迫在眉睫。張黎等[26]以解脂耶氏酵母為出發(fā)菌株，利用基因擴增技術(shù)，首次實現(xiàn)了脂肪酶基因LIP1在巴斯德畢赤酵母中的功能性表達，使脂肪酶的基因資源進一步得到延伸，又通過重疊延伸聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，促進了基因LIP1的高效表達。同時也構(gòu)建了GAP強啟動子的組成型表達載體PGAP9K，成功的使脂肪酶Lip1分泌到胞外。通過對原始密碼子基因LIP1以及密碼子優(yōu)化后的基因mlip1構(gòu)建重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)密碼子優(yōu)化可使脂肪酶表達水平大大提高，從而進一步提高了脂肪酶的表達量。遺憾的是，目前尚未有采用解脂耶氏酵母進行批量生產(chǎn)脂肪酶的報道，但相信隨著科學研究的進行，解脂耶氏酵母可能會成為生產(chǎn)脂肪酶的主力軍。

5 解脂耶氏酵母脂肪酶的應(yīng)用研究

解脂耶氏酵母脂肪酶可以利用眾多廉價底物并且可以產(chǎn)生很多有工業(yè)應(yīng)用價值的代謝底物。本部分僅從以下四方面闡述該酵母生產(chǎn)的脂肪酶的應(yīng)用現(xiàn)狀。

5.1 脂肪酶在環(huán)境治理中的作用

隨著社會各個方面快速發(fā)展，對石油需求日益增多，每年產(chǎn)生的石油污染物也迅速增加，油脂廢水中的高油脂含量、高化學需氧量（chemical oxygen demand，COD）和生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）引發(fā)很大的環(huán)境問題，極大的威脅人類的安全。而現(xiàn)在處理油脂廢水采用的方法主要有物理法、化學法和生物法，由于物理法和化學法周期長、成本高而且可能造成二次污染，故不常用。相比較而言生物法處理效率高、成本低、占地少、不需特殊設(shè)備等優(yōu)點用來處理油脂廢水更為合適。而生物法中又以解脂耶氏酵母最有優(yōu)勢，因為解脂耶氏酵母能夠分泌多種脂肪酶且它能在油脂廢水中存活很長時間。脂肪酶不僅可以有效處理油脂加工過程中所產(chǎn)生的含脂廢物，還可以處理石油開采和和煉制過程中產(chǎn)生的石油泄漏。因此可以直接在活性污垢中進行油脂廢水的處理，但直接應(yīng)用脂肪酶使油脂廢水處理效果不佳。如果能在水油脂雙相體系中添加一種有機溶劑，這種溶劑既能夠很好的溶解脂肪酸和油脂，還對酶穩(wěn)定性影響很小，則在脂肪酶催化油脂水解的過程中可以大大的提高油脂水解度。唐靜[27]通過一種新型技術(shù)得到了一種全細胞脂肪酶，他們主要是通過克隆高效降解脂肪酶基因，將高水解活性脂肪酶表達在解脂耶氏酵母細胞表面而獲得，這種脂肪酶不僅有效提高了污水中油脂和COD的去除率，還降低了成本，減少了工藝流程。該脂肪酶全細胞酶劑還可以用于土壤污染的恢復。

5.2 脂肪酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）俗稱腦黃金，屬于ω-3不飽和脂肪酸家族中的重要成員，對人體非常重要，既可以降低血液中三酸甘油酯和膽固醇的含量，預防血栓形成，還可以抑制發(fā)炎，調(diào)節(jié)免疫與防治癌癥等[28-29]。DHA還可以減少產(chǎn)后抑郁與改善老年癡呆，促進胎兒大腦發(fā)育。人體需要攝入一些含有DHA的食物或者保健品來滿足人類的健康需求。要想獲得更優(yōu)質(zhì)的DHA就必須開發(fā)更好的生產(chǎn)方式，而解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2，是水解魚油富集DHA的理想催化劑之一。但是由于耐受性差，易溶于水，不易與產(chǎn)物分離，價格昂貴而且不能回收利用等缺陷嚴重影響了解脂耶氏酵母中脂肪酶Lip2的廣泛應(yīng)用，張曉焰[30]通過固定化工藝對游離酶進行了改造。通過一系列固定化工藝，并對固定化脂肪酶Lip2與游離脂肪酶Lip2的酶學性質(zhì)進行考察發(fā)現(xiàn)，固定化的脂肪酶Lip2的pH穩(wěn)定性與熱穩(wěn)定性比游離態(tài)有了顯著的提高，而且操作溫度性更好，生產(chǎn)成本進一步降低，效率進一步提高。

5.3 脂肪酶在生物柴油中的應(yīng)用

生物柴油是利用可產(chǎn)生油料的動物植物以及微生物等為原料，通過催化反應(yīng)合成柴油燃料。常用的催化劑分為酸、堿和酶。與酸和堿相比，脂肪酶催化的生產(chǎn)工藝更簡單，條件更溫和以及對材料要求更低而且還無污染[31-32]。但脂肪酶的成本太高導致了利用酶法進行商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。劉文山[33]開發(fā)了脂肪酶表面展示技術(shù)。展示的宿主包括噬菌體、細菌和酵母等。展示的脂肪酶與自由酶相比熱穩(wěn)定性更強，有機溶劑更穩(wěn)定。這種技術(shù)是將酶固定在細胞表面，從而讓底物更容易進入，同時得到產(chǎn)物也更加方便。該研究為酶法制備生物柴油的廣泛應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

5.4 脂肪酶在家禽養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用

王耀鋒[34]成功構(gòu)建一種新型解脂耶氏酵母脂肪酶，這種脂肪酶的最適溫度和最適pH與肉雞體內(nèi)生理環(huán)境的適應(yīng)性最良好，而且在較低pH下，穩(wěn)定性也比較好，因此，在飼料工業(yè)中可以廣泛的被應(yīng)用。這種脂肪酶在添加了適宜保護劑后獲得了具有較高穩(wěn)定性的脂肪酶制劑，將該脂肪酶制劑應(yīng)用到動物試驗中，將解脂耶氏酵母脂肪酶添加到肉雞的飼料中，提高了飼料油脂利用率，并對肉雞生長性能、脂質(zhì)代謝和安全性進行了全面評估。結(jié)果顯示，單獨添加酵母菌和脂肪酶以及混合添加酵母菌和脂肪酶的5組與對照組相比，屠宰率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率、腹脂率、內(nèi)臟指數(shù)、空腸長度指數(shù)均無顯著差異，展現(xiàn)了良好的飼用安全性。

6 展望

解脂耶氏酵母脂肪酶在食品化工等各個方面具有很高的應(yīng)用潛力，它在食品生產(chǎn)、柴油制備、廢物處理等方面具有獨特的優(yōu)勢，而且在食品工業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的很多廢棄物可以被脂肪酶當做底物來生產(chǎn)多種產(chǎn)品。但是目前對于脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用還有許多關(guān)鍵環(huán)節(jié)受到制約，所以實現(xiàn)脂肪酶的批量生產(chǎn)及尋找影響其發(fā)揮最大效能的因素還有待探究。另外，在微觀層面上，對脂肪酶Lip2、Lip7、Lip8等的研究相對較多，但是其他脂肪酶研究則較少，這也是限制脂肪酶廣泛應(yīng)用的一個原因，更多的研究有待進一步的開展。