廣東惠州地區(qū)新生兒5000例應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查遺傳代謝病的結(jié)果及跟蹤隨訪分析

張志強(qiáng) 趙雨香 曾業(yè)熙

【摘要】 目的：觀察廣東惠州地區(qū)新生兒5 000例應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（tandem mass spectrometry，MSMS）篩查遺傳代謝病的結(jié)果，進(jìn)行跟蹤隨訪分析。方法：選取廣東惠州地區(qū)新生兒5 000例為研究對(duì)象，以MSMS篩查其遺傳代謝病，并對(duì)確診病例進(jìn)行跟蹤隨訪分析。結(jié)果：5 000例新生兒中，篩查出陽(yáng)性106例（2.12%），最后確診16例，陽(yáng)性發(fā)生率1︰313，其中男11例，女5例，包括氨基酸代謝異常10例，有機(jī)酸代謝異常4例，脂肪酸代謝異常2例。MSMS篩查靈敏度100%，特異度98.19%，假陽(yáng)性率1.81%;跟蹤隨訪平均10個(gè)月，其中12例[9例（56.25%）氨基酸代謝異常、2例（12.50%）脂肪酸代謝異常及1例（6.25%）有機(jī)酸代謝異常]未表現(xiàn)出顯著癥狀;楓糖尿癥、戊二酸血癥Ⅰ型、甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥者均具有智力發(fā)育遲緩與運(yùn)動(dòng)能力發(fā)育滯后表現(xiàn);鳥(niǎo)氨酸氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶缺乏者產(chǎn)生嗜睡、抽搐癥狀與高氨血癥。結(jié)論：MSMS篩查新生兒遺傳代謝病靈敏度及特異度均較高，但同時(shí)存在一定程度假陽(yáng)性率，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

【關(guān)鍵詞】 廣東惠州 新生兒 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) 遺傳代謝病

[Abstract] Objective： To observe the screening results of inherited metabolic diseases by tandem mass spectrometry （MSMS） from 5 000 newborns in Huizhou， Guangdong， and to conduct follow-up analysis. Method： A total of 5 000 newborns in Huizhou， Guangdong were enrolled as subjects. The inherited metabolic diseases were screened by MSMS. The confirmed cases were followed up and analyzed. Result： Among 5 000 newborns， there were 106 cases （2.12%） positive， and 16 cases finally confirmed， the positive incidence rate was 1︰313. There were 11 males and 5 females， included 10 cases with abnormal amino acid metabolisms， 4 cases with abnormal organic acids metabolism， and 2 cases with abnormal fatty acid metabolism. The sensitivity， specificity and false positive rate of MSMS screening were 100%， 98.19% and 1.81%， respectively. The duration of follow-up was 10 months， there were 12 cases [9 cases （56.25%） with amino acid metabolism abnormalities， 2 cases （12.50%） with fatty acid metabolism abnormalities and 1 case （6.25%） with organic acid metabolism abnormalities] not showed significant symptoms. There were manifestations such as mental development retardation and motor ability retardation in patients with maple syrup urine disease， glutaric aciduria Ⅰ， methylmalonic acidemia with homocysteine. The patients with lack of ornithine carbamoyl phosphate transferase were easily accompanied with drowsiness， convulsions and hyperammonemia. Conclusion： The sensitivity and specificity of MSMS are high for screening neonatal inherited metabolic diseases， but at the same time， there is a certain degree of false positive rate， which needs further improvement.

[Key words] Huizhou， Guangdong Newborn Tandem mass spectrometry Inherited metabolic disease

First-authors address： Huizhou Second Maternal and Child Health and Family Planning Service Center， Huizhou 516001， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.021

遺傳代謝病主要指因基因突變使得糖、微量元素、蛋白以及脂肪代謝反應(yīng)中重要載體或者酶分子等缺失導(dǎo)致的疾病，一般是單基因遺傳病。現(xiàn)階段，常見(jiàn)遺傳代謝病高達(dá)500種，新生兒總體患病率約為1︰3 000，若依據(jù)中國(guó)每年出生1 500萬(wàn)新生兒進(jìn)行計(jì)算，每年遺傳代謝病患兒有5 000例，其中每天新增例數(shù)為14例左右[1-3]。該類疾病對(duì)新生兒造成嚴(yán)重危害，通常能引起智力障礙，甚至危及生命。早期診治，特別是癥狀產(chǎn)生前的有效篩查，對(duì)遺傳代謝病患兒預(yù)后意義重大[4]。當(dāng)前，日本、美國(guó)以及德國(guó)等國(guó)家已經(jīng)在遺傳代謝病篩查中采取了用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（tandem mass spectrometry，MSMS）。本文以5 000例新生兒為研究對(duì)象，探討MSMS對(duì)其遺傳代謝病篩查結(jié)果及隨訪情況?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月-2018年4月廣東惠州地區(qū)新生兒5 000例。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①新生兒父母為本地常住人口;②活產(chǎn)兒;③家屬同意行MSMS篩查。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：可疑陽(yáng)性，但由于各種原因未參與確診試驗(yàn)者。其中男2 714例，女2 286例;出生體重1 500～2 500 g 198例，>2 500 g 4 802例;早產(chǎn)兒212例，足月兒4 788例，本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 依據(jù)《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（2010年版）》相關(guān)要求，在嬰兒出生72 h后，于腳跟內(nèi)、外側(cè)進(jìn)行采血，然后滴于903特殊濾紙片待其自然晾干，最后置于2～8 ℃冰箱之中保存，注意于1周內(nèi)及時(shí)送檢。

1.2.2 檢測(cè)方法 采用三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（型號(hào)：API 3200MDTM，購(gòu)自AB Sciex Pte.Ltd）;從干血濾紙中選取圓形濾紙血片，直徑長(zhǎng)為3 mm，放在96孔聚丙烯板之內(nèi)，琥珀酰丙酮和非衍生化多種氨基酸、肉堿測(cè)定試劑盒及相關(guān)質(zhì)控樣品購(gòu)自廣州市豐華生物工程有限公司（注冊(cè)證號(hào)：國(guó)械注準(zhǔn)20163401324）。對(duì)于檢測(cè)項(xiàng)目，主要為10個(gè)氨基酸、24個(gè)酰基肉堿及其對(duì)應(yīng)具體比值。

1.2.3 檢測(cè)數(shù)據(jù)分析 通過(guò)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方法得到數(shù)據(jù)，并以配套分析軟件處理后得到各目標(biāo)代謝物具體絕對(duì)值濃度。對(duì)于截?cái)嘀荡_定，需依據(jù)10 000例正常新生兒予以截?cái)嘀涤?jì)算，規(guī)定實(shí)驗(yàn)室獲取值第0.1以及第99.9個(gè)百分位值組成的區(qū)間是該實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)正常參考水平范圍，相關(guān)截?cái)嘀狄罁?jù)樣本變化不斷修正，如果分析物>截?cái)嘀?，則需重新操作1次，如果仍然較高，則需2～3周復(fù)查。MSMS陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：分析物嚴(yán)重高于截?cái)嘀?，立即召回予以再次檢查之后，檢查結(jié)果依然為同一指標(biāo)嚴(yán)重高于截?cái)嘀?，則可判斷為陽(yáng)性，并歸為可疑患者;陰性標(biāo)準(zhǔn)：分析物低于截?cái)嘀礫5]。

1.2.4 可疑患者確診試驗(yàn) 對(duì)MSMS檢測(cè)陽(yáng)性者予以血常規(guī)、生化、尿有機(jī)酸、血糖、血氨、尿酮體、乳酸、丙酮酸以及同型半胱氨酸檢查，同時(shí)開(kāi)展血?dú)夥治鲆约盎蚍治?，完成確診試驗(yàn)。對(duì)確診患兒進(jìn)行跟蹤隨訪?？梢苫颊叽_診診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）氨基酸代謝異常疾病依據(jù)《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范（2010年版）》進(jìn)行評(píng)估：對(duì)高苯丙氨酸血癥（檢測(cè)顯示血苯丙氨酸水平持續(xù)超過(guò)120 ?mol/L）予以尿蝶呤譜分析以及二氫蝶啶還原酶（DHPR）分子活性測(cè)定予以鑒別診斷，其中高苯丙氨酸血癥確定排除BH4缺乏癥后，如果血苯丙氨酸水平≥360 ?mol/L，則診斷為苯丙酮尿癥，如果血苯丙氨酸水平<360 ?mol/L，則診斷輕度高苯丙氨酸血癥。（2）脂肪酸代謝障礙：對(duì)于原發(fā)性肉堿吸收障礙，需要參考MSMS里面血漿肉堿水平變化情況，若持續(xù)明顯降低，則可確診。（3）有機(jī)酸代謝障礙疾病通過(guò)尿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）加以明確診斷，戊二酸血癥Ⅰ型：戊二酰肉堿增高，并且戊二酰肉堿/辛酰肉堿結(jié)果提升，游離肉堿減少，經(jīng)基因分析，發(fā)現(xiàn)GCDH 2個(gè)等位基因具有致病突變;甲基丙二酸血癥：尿同型胱氨酸檢測(cè)均顯示存在過(guò)量含硫氨基酸。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察總體篩查結(jié)果，以確診結(jié)果作為對(duì)照，分析MSMS檢測(cè)準(zhǔn)確性、靈敏度與特異度;觀察脂肪酸、氨基酸與有機(jī)酸代謝異常檢出情況，并分析隨訪情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 總體篩查結(jié)果 5 000例新生兒中，篩查出陽(yáng)性106例（2.12%），最后確診16例，陽(yáng)性發(fā)生率1︰313，其中男11例，女5例，包括氨基酸代謝異常10例，有機(jī)酸代謝異常4例，脂肪酸代謝異常2例。MSMS篩查靈敏度100%，特異度98.19%，假陽(yáng)性率1.81%。見(jiàn)表1。

2.2 氨基酸代謝異常 本次確診患者中，氨基酸代謝異常10例，包括高苯丙氨酸血癥5例，精氨酸血癥、楓糖尿癥、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶缺乏、瓜氨酸血癥以及瓜氨酸血癥Ⅱ型患者各1例。

2.3 有機(jī)酸代謝異常 本次確診患者中，有機(jī)酸代謝異常4例，包括戊二酸血癥Ⅰ型、甲基丙二酸血癥、甲基丙二酸合并丙酸血癥以及甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥患者各1例。

2.4 脂肪酸代謝異常 本次確診患者中，脂肪酸代謝異常新生兒2例，均存在原發(fā)性肉堿吸收障礙。

2.5 跟蹤隨訪分析 16例確診新生兒，平均跟蹤隨訪時(shí)間為10個(gè)月，其中12例[9例（56.25%）氨基酸代謝異常、2例（12.50%）脂肪酸代謝異常以及1例（6.25%）有機(jī)酸代謝異常]未表現(xiàn)出顯著癥狀。楓糖尿癥、戊二酸血癥Ⅰ型、甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥者具有智力發(fā)育遲緩與運(yùn)動(dòng)能力發(fā)育滯后表現(xiàn);鳥(niǎo)氨酸氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶缺乏者產(chǎn)生嗜睡、抽搐癥狀與高氨血癥。

3 討論

遺傳代謝病屬于對(duì)嬰幼兒身體健康造成嚴(yán)重危害的疾病，因?yàn)榧膊》N類繁多，新生兒?jiǎn)我患膊“l(fā)病率不高，在醫(yī)療資源較為有限背景下，國(guó)家通過(guò)進(jìn)行公共衛(wèi)生立法，將發(fā)病率較高、影響嚴(yán)重、早期發(fā)現(xiàn)且給予治療后可以取得良好預(yù)后的相應(yīng)疾病納入各地區(qū)新生兒群體篩查，同時(shí)獲得了較為良好社會(huì)效益[6-8]。我國(guó)各地區(qū)由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展、醫(yī)療水平以及疾病發(fā)生情況均存在差異，需對(duì)新生兒遺傳代謝病篩查力度與疾病種類予以不同程度增加[9]。

從20世紀(jì)60年代Niu等[10]首先實(shí)施細(xì)菌抑制法進(jìn)行苯丙酮尿癥臨床篩查以來(lái)，不少國(guó)家均已在一定程度上實(shí)施了遺傳代謝病相關(guān)篩查工作。以往常用疾病篩查手段包括時(shí)間分辨熒光分析法、細(xì)菌抑制法、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法與熒光法等，只能在1次實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行1種疾病檢測(cè)，但是遺傳代謝病屬于病種較多疾病，如果使用這些篩查手段，不僅會(huì)明顯增加工作量，同時(shí)還會(huì)降低篩查效率。隨著醫(yī)療技術(shù)持續(xù)發(fā)展，新生兒疾病篩查工作中的病種也逐漸增多，特別是MSMS技術(shù)的實(shí)施，明顯擴(kuò)展了既往篩查疾病譜，為當(dāng)前遺傳代謝病篩查工作中最理想的一種分析技術(shù)[11-15]。質(zhì)譜基本原理如下：將分析物離子化，使其成為各種帶電粒子（具有不同質(zhì)荷比），通過(guò)電磁學(xué)原理，將這些帶電粒子依據(jù)質(zhì)荷比于空間或者于時(shí)間上產(chǎn)生分離，并且排列成圖譜，然后按照?qǐng)D譜與離子峰值情況對(duì)分析物予以鑒定、定量[16-17]。所謂MSMS，即串聯(lián)兩臺(tái)質(zhì)譜儀，其中第1臺(tái)是分離器，而另1臺(tái)為分析儀，能夠分析分析物解離后各種帶電粒子，且其檢測(cè)水平能夠達(dá)到pg級(jí)，能于幾分鐘內(nèi)完成一個(gè)樣本之中幾十個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)，同時(shí)所需樣本量小。遺傳代謝病的出現(xiàn)受胎兒基因與生存環(huán)境共同影響，在線人類孟德?tīng)栠z傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）顯示，現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)遺傳代謝病2萬(wàn)余種，包括500種左右的常見(jiàn)病，這種疾病在人類出生缺陷中占非常重要的地位[18-19]。

本次研究對(duì)廣東惠州地區(qū)5 000例應(yīng)用MSMS篩查的新生兒進(jìn)行調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)可疑陽(yáng)性新生兒106例（2.12%），最后確診16例[氨基酸代謝異常10例（高苯丙氨酸血癥5例，精氨酸血癥、楓糖尿癥、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶缺乏、瓜氨酸血癥以及瓜氨酸血癥Ⅱ型患者各1例），有機(jī)酸代謝異常4例（戊二酸血癥Ⅰ型、甲基丙二酸血癥、甲基丙二酸并丙酸血癥以及甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥患者各1例），脂肪酸代謝異常2例（原發(fā)性肉堿吸收障礙）]，陽(yáng)性發(fā)生率1︰313，與尹峰[20]研究結(jié)果相比較高，可能與研究樣本量以及地區(qū)差異等相關(guān)。與確診結(jié)果對(duì)照發(fā)現(xiàn)，MSMS篩查靈敏度100%，特異度98.19%，假陽(yáng)性率1.81%，表明MSMS篩查新生兒遺傳代謝病具有較高特異度及靈敏度，但亦具有一定程度假陽(yáng)性率，需要進(jìn)一步改進(jìn)。MSMS技術(shù)在新生兒遺傳代謝病篩查過(guò)程中具有很多優(yōu)勢(shì)，但其于臨床應(yīng)用中依然存在不少局限性，包括儀器價(jià)格昂貴、維護(hù)費(fèi)用相對(duì)較高、必須配備熟悉儀器正確使用方式的相應(yīng)技術(shù)人員;同時(shí)，檢測(cè)結(jié)果較容易受部分藥物或者新生兒體重、孕周與其營(yíng)養(yǎng)狀況等個(gè)體因素影響，需臨床檢查醫(yī)師綜合分析檢測(cè)結(jié)果。因?yàn)镸SMS篩查的病種通常較少見(jiàn)，需臨床專科醫(yī)生熟悉疾病診治過(guò)程，并對(duì)患兒予以定期隨訪。如果MSMS檢測(cè)指標(biāo)顯示異常，尚無(wú)法明確診斷疾病，需結(jié)合患者臨床癥狀以及尿GC-MS等其他檢測(cè)指標(biāo)、基因分析、酶活性檢測(cè)等確診。對(duì)確診新生兒進(jìn)行跟蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)其預(yù)后情況為：9例氨基酸代謝異常、2例脂肪酸代謝異常以及1例有機(jī)酸代謝異常者并未產(chǎn)生明顯癥狀，而其他患者則產(chǎn)生智力發(fā)育遲緩、身體運(yùn)動(dòng)發(fā)育滯后、高氨血癥、嗜睡以及抽搐等表現(xiàn)。

綜上，在新生兒遺傳代謝病篩查中采取MSMS方法，篩查結(jié)果靈敏度與特異度非常高，但因存在一定程度假陽(yáng)性率，故有待進(jìn)一步改進(jìn)，該篩查方式可在一定程度上改善患者預(yù)后，具有推廣與普及意義。

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（收稿日期：2019-04-22） （本文編輯：程旭然）