分子標(biāo)記輔助選育香型軟米水稻“上師大18號(hào)”

朱小方, 孫雙燕, 曾文秀, 趙國超, 李建粵

(上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234)

隨著人民生活水平的提高和稻米市場的開放,全球市場對(duì)稻米食味品質(zhì)都提出了更高的要求,優(yōu)質(zhì)稻育種成為水稻育種十分重要的研究方向[1-2].香型軟米因其在蒸煮時(shí)有特殊香味,食用時(shí)米飯軟滑、清香爽口,冷后不回生等特點(diǎn),不僅受到消費(fèi)者喜愛,而且在國際稻米市場上也享有特殊地位[3].TIAN等[4]研究發(fā)現(xiàn)有10 個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)稻米食味品質(zhì)指標(biāo)影響較大,分別是:Wx,SSII-3,SBE3,AGPiso,SSIV-2,ISA,AGPlar,SSI,SSIII-2,PUL.其中,決定稻米直鏈淀粉含量和膠稠度的主效基因都是Wx,即蠟質(zhì)基因.因此,蠟質(zhì)基因被認(rèn)為是影響稻米食味品質(zhì)最重要的基因.

“光明粳2號(hào)”是由光明種業(yè)有限公司培育出的一種香粳型常規(guī)水稻.“光明粳2號(hào)”產(chǎn)量高,結(jié)實(shí)率高,在上海種植熟期也較早[5],但該水稻的稻米不是軟米.本研究采用分子標(biāo)記輔助常規(guī)育種技術(shù),以“光明粳2號(hào)”水稻為轉(zhuǎn)育親本,成功選育出香型軟米水稻“上師大18號(hào)”,并對(duì)“上師大18號(hào)”水稻主要農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和品質(zhì)性狀進(jìn)行分析.培育新型軟香型水稻新品系,符合目前市場對(duì)優(yōu)質(zhì)稻米的需求.

1 材料與方法

1.1 材 料

選取“光明粳2號(hào)”(審定編號(hào):滬農(nóng)品審水稻2013第003號(hào))與“青香軟粳”(審定編號(hào):滬農(nóng)品審水稻2014第004號(hào))2種水稻,作為“上師大18號(hào)”水稻選育的親本材料.

1.2 分子標(biāo)記檢測(cè)軟米基因

取水稻幼嫩葉片,提取葉片總DNA.采用分子標(biāo)記檢測(cè)軟米基因使用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物序列,PCR擴(kuò)增條件以及PCR產(chǎn)物酶切操作均參考文獻(xiàn)[6].酶切產(chǎn)物使用2%(體積分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電泳參數(shù):120 V,30 min,溴化乙錠(EB)染色;取出凝膠在紫外成像儀上觀察、照相.

1.3 主要農(nóng)藝性狀以及產(chǎn)量性狀考查

水稻成熟時(shí),在“光明粳2號(hào)”水稻和“上師大18號(hào)”水稻種植小區(qū)中,隨機(jī)選取5棵單株,分別測(cè)量劍葉尖端至地面的高度(簡稱劍葉高度)和株高,調(diào)查每株的有效穗數(shù)、每株實(shí)粒數(shù),計(jì)算結(jié)實(shí)率和總粒數(shù),稱量千粒重和單株重,最后進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析.

1.4 稻米品質(zhì)指標(biāo)分析

取500 g“上師大18號(hào)”水稻稻谷,送農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,進(jìn)行稻米品質(zhì)指標(biāo)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 香型軟米水稻選育過程

“光明粳2號(hào)”和“青香軟粳”水稻都屬于甜菜堿醛脫氫酶第二外顯子突變類型的香稻.“青香軟粳”水稻除了具有香味基因外,還含有軟米基因[7].2012年3月,以上海光明種業(yè)有限公司許建華研究員惠贈(zèng)的“光明粳2號(hào)”水稻為母本,以含有軟米基因的水稻“青香軟粳”為父本進(jìn)行雜交,4月收獲F1種子.同年5月種植F1種子.F1植株開花后,以“光明粳2號(hào)”水稻為母本,F1植株為父本進(jìn)行回交,9月收獲回交一代種子BC1F1.2012年12月在海南三亞種植BC1F1種子,2013年3月繼續(xù)以“光明粳2號(hào)”水稻為母本,BC1F1為父本再次回交,4月得到BC2F1種子.2013年5月,在上海種植BC2F1種子,8月底至9月初又以“光明粳2號(hào)”水稻為母本,BC2F1為父本繼續(xù)回交得到BC3F1種子.2013年12月,在海南三亞種植BC3F1種子,2014年4月收獲BC3F2種子.在每一代進(jìn)行回交前,都采用分子標(biāo)記輔助對(duì)將要作為回交父本的植株進(jìn)行軟米基因檢測(cè),總是以具有軟米基因的植株作為繼續(xù)回交的父本.2014年5月,在上海大量種植BC3F2種子,在9月初考察BC3F2植株,選取開花時(shí)期與“光明粳2號(hào)”水稻接近的單株,取葉片進(jìn)行軟米基因檢測(cè),10月從軟米基因純合植株上收獲BC3F3種子.2014年12月—2015年4月,在海南三亞以小區(qū)擴(kuò)繁軟米基因純合單株的BC3F3種子,4月從各項(xiàng)農(nóng)藝性狀都一致的小區(qū)中混收BC3F4種子,并將其定名為“上師大18號(hào)”.

2.2 軟米基因分子標(biāo)記檢測(cè)

WANG等[6]研究發(fā)現(xiàn):軟米水稻與非軟米水稻在第4外顯子+693處鳥嘌呤脫氧核苷酸/腺嘌呤脫氧核苷酸(G/A)存在差異.采用其報(bào)道的軟米基因分子標(biāo)記檢測(cè)方法,水稻基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為385 bp.含有軟米基因水稻基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)NlaⅢ內(nèi)切酶消化后,能被剪切成215 bp和170 bp兩種長度的DNA條帶,而含非軟米基因水稻基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不能被NlaⅢ內(nèi)切酶消化,仍為385 bp條帶.

以“青香軟粳”和“光明粳2號(hào)”兩種水稻分別作為軟型和非軟型水稻的對(duì)照,分析了以“青香軟粳”與“光明粳2號(hào)”為親本雜交、回交和自交的植株.與“光明粳2號(hào)”水稻回交1次(BC1F1)、2次(BC2F1)和3次(BC3F1)的后代植株,利用軟米基因分子標(biāo)記檢測(cè),電泳圖譜都呈現(xiàn)出2種不同的帶型:1)只有385 bp的條帶;2)同時(shí)具有385,215,170 bp的3條條帶(圖1).對(duì)于需要繼續(xù)回交的植株,都是選擇同時(shí)具有385,215,170 bp 3條條帶,即軟米基因呈雜合狀態(tài)的植株.從含有雜合軟米基因的BC3F1植株上收獲BC3F2種子并種植,同樣采用軟米基因分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè).BC3F2植株有3種帶型:1)只有385 bp的條帶;2)具有215 bp和170 bp 2條條帶;3)同時(shí)具有385,215,170 bp 3條條帶(圖2).這3種帶型植株的軟米基因分別對(duì)應(yīng)的是非軟純合、軟型純合和雜合3種基因型.

圖1 “青香軟粳”與“光明粳2號(hào)”雜交再回交后代植株軟米基因檢測(cè)圖譜.M:100 bp標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量DNA；1：“青香軟粳”對(duì)照；2：“光明粳2號(hào)”對(duì)照；3～17：回交后代植株

圖2 “青香軟粳”與“光明粳2號(hào)” 雜交回交再自交后代植株軟米基因檢測(cè)圖譜.M:100 bp標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量DNA；1:“青香軟粳”對(duì)照；2：“光明粳2號(hào)”對(duì)照；3～17：回交再自交后代植株

2.3 “上師大18號(hào)”和“光明粳2號(hào)”水稻主要農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量性狀分析

2017年5月,在上海種植香型軟米水稻新品系“上師大18號(hào)”和“光明粳2號(hào)”水稻.分別在8月下旬和10月中旬考察了2種水稻的開花期和種子的成熟期.結(jié)果顯示:2種水稻均在8月下旬開花.全生育期接近,均為148 d.水稻成熟后,在2個(gè)小區(qū)的中間各隨機(jī)取5棵單株,測(cè)定并比較2種水稻的主要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀.

主要農(nóng)藝性狀檢測(cè)結(jié)果顯示:“上師大18號(hào)”水稻和“光明粳2號(hào)”水稻劍葉高度和單株有效穗數(shù)都比較接近,統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果都沒有顯著差異(P>0.05)(表1).“上師大18號(hào)”水稻株高比“光明粳2號(hào)”水稻略矮,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,兩者之間也沒有顯著差異(P>0.05)(表1).比較“上師大18號(hào)”水稻和“光明粳2號(hào)”水稻涉及產(chǎn)量性狀的每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、單株重,兩者也都比較接近,統(tǒng)計(jì)分析差異也都不顯著(P>0.05)(表2).

表1 “上師大18號(hào)”水稻和“光明粳2號(hào)”水稻主要農(nóng)藝性狀比較

注:相同小寫字母上標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)

表2 “上師大18號(hào)”水稻和“光明粳2號(hào)”水稻產(chǎn)量性狀比較

注:相同小寫字母上標(biāo)表示差異不顯著(P>0.05)

2.4 稻米品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)

“上師大18號(hào)”水稻稻谷經(jīng)農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心分析,結(jié)果顯示:糙米率為82.7%,整精米率為69.4%,堊白度為21%,透明度為3級(jí),堿消值為6.5級(jí),膠稠度為74 mm,直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.2%,精米率為74%,粒長為5.2 mm,長寬比為1.8,堊白粒率為77%,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.8%.

3 討 論

我國稻種資源豐富,類型復(fù)雜,其中不乏口感與蒸煮性質(zhì)相當(dāng)優(yōu)秀的品種,但多數(shù)稻米的食用品質(zhì)目前還不夠理想.而且,隨著人民生活水平的提高和稻米市場的開放,優(yōu)質(zhì)米育種已成為水稻育種中十分重要的研究方向.軟米是云南特有的優(yōu)質(zhì)米資源,其米質(zhì)介于糯米與粘米之間[8].最近幾年,香型軟米也已越來越受到上海等周邊地區(qū)百姓的喜愛,并且上海育種單位也已先后培育出適合本地種植的香型軟米水稻[9-10].

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,目前已有較多研究者采用分子標(biāo)記技術(shù)輔助培育各種水稻新品系[6,11-15].“南粳46”水稻是首個(gè)在江蘇省利用分子標(biāo)記輔助成功選育的香型軟米水稻[6].胡大明等[9]在“南粳46”水稻中利用系統(tǒng)選育方法,獲得熟期比“南粳46”水稻早大約4 d的香型軟米水稻“青香軟粳”.有報(bào)道顯示,“南粳46”水稻和“青香軟粳”水稻稻米直鏈淀粉含量分別為10.2%和8.7%[16].本研究獲得的“上師大18號(hào)”水稻稻米直鏈淀粉含量為8.2%,也屬于軟米水稻.

近幾年“南粳46”和“青香軟粳”水稻在上海市種植的香型軟米水稻中占有較大比例.在上海市5月種植,這兩種水稻全生育期大約分別是157 d和153 d[17].本研究采用分子標(biāo)記輔助方法選育了“上師大18號(hào)”水稻,其米質(zhì)與“南粳46”和“青香軟粳”水稻相似,都屬于香型軟米.“上師大18號(hào)”水稻全生育期只有148 d左右,比“青香軟粳”水稻的育期縮短了5 d.“上師大18號(hào)”水稻的成功選育將為上海市推廣生育期相對(duì)較短的香型軟米水稻提供了選擇.