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    迷迭香酸的添加對明膠凝膠體系的影響

    2019-01-14 10:37:32張曉潔馬良馬明思鄭紅孫藝張宇昊
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2018年12期
    關(guān)鍵詞:明膠提取物凝膠

    張曉潔,馬良,馬明思,鄭紅,孫藝,張宇昊

    (西南大學 食品科學學院,重慶,400715)

    明膠是由動物皮膚、骨、肌膜、肌腱等結(jié)締組織中的膠原部分降解而成的天然生物高分子材料之一,因其具有良好的膠凝性、溶脹性和成膜性等,被廣泛應用于食品、材料、醫(yī)藥和攝影行業(yè)[1]。明膠屬于熱可逆型凝膠,環(huán)境溫度的升高會降低明膠的凝膠特性,進而影響產(chǎn)品品質(zhì),這大大限制了明膠在食品工業(yè)的應用范圍。因此如何改善明膠的凝膠特性成為該領域研究的熱點。

    目前,明膠凝膠特性的改善有化學和物理方法,物理方法主要包括紫外照射、γ輻照和超高壓[2],KULISIEWICZ等[3]研究發(fā)現(xiàn)將明膠于200MPa下作用30min后,與對照相比,明膠的儲能模量提高到四倍,凝膠特性也得到改善。物理方法雖不會引入外源性物質(zhì),但存在明膠復性和均一性較差等問題?;瘜W方法主要是將戊二醛、碳化二亞胺、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和京尼平等化學交聯(lián)劑加入到明膠中,通過與明膠鏈之間的交聯(lián)作用來改善凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu),使得明膠性能得以提高[4-5],MOHTAR等[6]將戊二醛加入魚皮明膠中,發(fā)現(xiàn)明膠的凝膠強度和儲能模量都有所提高,但是有些交聯(lián)劑具有毒性,它們在食品和醫(yī)藥上的應用是不可接受的。近年來,將天然酚類提取物加入到明膠中,通過明膠與酚類物質(zhì)之間的共價或非共價相互作用來提高明膠的機械和流變性能已得到廣泛應用[7]。YASIN等[8]將檸檬草提取物加入雞腳明膠中,發(fā)現(xiàn)明膠的凝膠強度、熱穩(wěn)定性和彈性模量都有所提高;TEMDEE等[9]將富含丹寧酸的腰果樹皮提取物加入到烏賊皮明膠中,明膠的凝膠強度有顯著性提高。

    GMEZESTACA等[10]將迷迭香提取物加入到金槍魚皮中,發(fā)現(xiàn)明膠凝膠強度和損耗模量都有提高,但由于迷迭香提取物為混合物,無法明確其改善明膠凝膠特性的成分及改善機制。迷迭香酸(RosA)是迷迭香提取中主要成分之一,屬于天然多酚化合物[11],具有良好的抗氧化性、抗菌、抗炎和抗病毒活性[12]。本研究以RosA和兔皮明膠為原料,將不同質(zhì)量濃度的RosA加入明膠中,通過熒光光譜、凝膠強度、流變學性能和圓二色譜等方法研究明膠與RosA之間的相互作用,分析該相互作用對明膠的影響,為提高明膠的理化性質(zhì)和后期明膠-RosA可食性膜的制備提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    兔皮,購于重慶阿興記食品有限公司,原料獲取后洗凈凍藏于-20 ℃冰箱中備用。Ca(OH)2、HCl、Na2S、Nacl、(NH4)2S2O8、二甲基硅油和十二烷基硫酸鈉,成都市科龍化工試劑廠;迷迭香酸(純度97%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;β-巰基乙醇(2-ME)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍R-250和四甲基乙二胺(TEMED),加拿大BIO BASIC公司;質(zhì)量分數(shù)30%丙烯酰胺,北京索萊寶科技有限公司;標準蛋白為(分子質(zhì)量 10~200 kDa),加拿大Fermentas公司。其中Tris、考馬斯亮藍R-250、30%丙烯酰胺為優(yōu)級純,其他試劑均為分析純。

    1.2 主要儀器設備

    JA3003B型電子天平,上海精天電子儀器有限公司;PE20型實驗室pH計,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;HX-1005恒溫循環(huán)器,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;MOS-500圓二色譜儀,法國Bio-Logic公司;F-4500 熒光分光光度計,日本日立公司;Power PacTM基礎電泳儀,美國Bio-Rad公司;G: BOX EF型凝膠成像系統(tǒng),英國Syn-gene公司;DHR-1流變儀,美國TA公司;TA.XT2i物性測定儀,英國Stable Micro System公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 兔皮明膠的制備

    兔皮明膠的提取方法主要參照楊暉等[13]報道的基礎上,具體工藝如下:

    新鮮兔皮→去除皮下脂肪→脫毛→清洗、剪切→除雜蛋白→清洗→稀酸處理(質(zhì)量分數(shù)為1%的鹽酸)→提膠→過濾(用1.6 μm孔徑的濾膜真空過濾)→熱風干燥→成品明膠。

    所得明膠的提取率為(80.25±1.71)%,純度為(93.55±1.42)%。

    1.3.2 樣品的制備

    稱取2 g明膠于燒杯中,加入20 mL蒸餾水于60 ℃下溶解,分別配制質(zhì)量濃度為0、2.4、4.5、9.0和15 g/L的RosA溶液加入明膠溶液中,制成RosA的最終濃度為0、0.8、1.5、3.0和5.0 g/L的明膠溶液,明膠的最終濃度為66.7 g/L。以上溶液充分攪拌混勻后,于60 ℃下保溫30 min得到明膠-RosA共混溶液,之后在室溫下冷卻成膠。

    1.3.3 熒光光譜分析

    按照1.3.2方法配制一系列所需濃度的RosA-明膠共混溶液。用蒸餾水將共混液稀釋成明膠濃度為1 mg/mL,相應的RosA溶液濃度為0~0.07 mg/mL,分別于298、308和318 K下測定熒光光譜。熒光光譜條件為:激發(fā)波長λex=278 nm,發(fā)射波長λem=305 nm,波長范圍280~400 nm,入射和發(fā)射狹縫寬均為5 nm。同時,為了明確RosA對明膠的熒光淬滅方式,采用Stern-Vomler方程計算[14]。

    (1)

    式中:F0和F分別為未加和加入RosA時明膠的熒光強度;[Q]為RosA的濃度,Ksv為Stern-Vomler猝滅常數(shù),Kq為雙分子作用的動態(tài)猝滅速率常數(shù),τ0為熒光分子的平均壽命,一般為10-8s[15]。

    1.3.4 凝膠強度的測定

    參照GB 6783—2013[16]中凝膠強度的測定方法,將1.3.2配制的樣品在(10±0.1)℃恒溫循環(huán)器中凝凍16~18 h,采用TA.XT2i物性測定儀測定凝膠強度。用SMSP/0.5圓柱型探頭以1 mm/s的下壓速度壓入凝膠4 mm,得出凝膠強度數(shù)值。以上試驗重復3次。

    1.3.5 流變性能的測定

    采用DHR-1流變儀測定1.3.2配制的樣品的黏彈性。流變儀的參數(shù)設置主要參照陳麗清等[17],測試夾具40 mm Al平板,板間距為0.10 mm,樣品于流變儀上由40 ℃冷卻到5 ℃,在5 ℃下保持2 min,然后由5 ℃加熱到40 ℃,測定儲能模量G′和損耗模量G″隨溫度掃描的變化并計算相角δ,在動態(tài)黏彈性分析中,通常以tanδ= 1作為明膠膠凝和熔化溫度的轉(zhuǎn)折點,分別對應于膠凝溫度和熔化溫度。

    1.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)

    將1.3.2配制的樣品用蒸餾水稀釋成明膠濃度為2 mg/mL,按體積比 4∶1添加樣品緩沖液充分混勻,沸水浴5 min,冷卻后上樣[9]。上樣量為10 μL,其中分離膠和濃縮膠的濃度分別為10%和5%,電流初始設置為 15 mA,待溴酚藍跑到分離膠中后,電流調(diào)至 25 mA,電泳時間約1 h。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍R-250進行染色,2 h后用脫色液于30 ℃下振蕩脫色,直至背景藍色被脫凈,然后用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳圖譜并用Gene Tools數(shù)據(jù)處理軟件進行分析。

    1.3.7 圓二色譜分析(circular dichroism, CD)

    將1.3.2配制的樣品用蒸餾水稀釋成明膠濃度為1 mg/mL,并進行圓二色譜分析,每個實驗重復3次。測定波長范圍為190~240 nm,反應條件為25 ℃,比色皿光程為1 mm,掃描速度為50 nm/min,記錄橢圓率并用圓二色軟件CDPro計算蛋白二級結(jié)構(gòu)組成。

    1.3.8 數(shù)據(jù)分析

    數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.6和SPSS 17.0軟件分析,每次試驗設置3個平行實驗,數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 熒光光譜分析

    在構(gòu)成明膠分子的18種氨基酸中,只有酪氨酸有熒光產(chǎn)生,其中酪氨酸的發(fā)射波長在304 nm左右。如圖1所示,RosA的加入造成熒光淬滅,使得熒光強度降低,說明兩者可能存在相互作用。通常來講,熒光淬滅可以分為動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅,動態(tài)猝滅依賴于擴散,即溫度的上升能夠增加分子的有效碰撞,因此Ksv也會隨著溫度的升高而增大,說明熒光淬滅主要是由分子碰撞造成,未產(chǎn)生分子間相互作用;而靜態(tài)猝滅是由于猝滅分子和熒光發(fā)色團結(jié)合而生成了一種基態(tài)復合物,隨著溫度的升高基態(tài)復合物的穩(wěn)定性將會降低,因此Ksv將會隨著溫度的升高而減小[18],說明分子間產(chǎn)生相互作用。

    圖1 RosA對明膠熒光光譜的影響Fig.1 Effects of RosA on the fluorescence spectra of gelatin 注:λex=278 nm,明膠濃度為1 mg/mL,a-g代表加入的RosA濃度 為0、0.004、0.007、0.01、0.02、0.04、0.07 mg/mL。

    由圖2和表1可知,隨著溫度的升高,Ksv在逐漸減少,說明明膠與RosA之間發(fā)生了相互作用,形成復合物,此外,Kq值(表1)的數(shù)量級遠大于動態(tài)猝滅的最大猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s),同樣說明兩者之間為靜態(tài)猝滅方式,產(chǎn)生了分子間的相互作用。

    圖2 不同溫度下RosA對明膠熒光光譜的影響Fig.2 Effects of RosA on the fluorescence spectra of gelatin at different temperatures

    表1 三種溫度下RosA與明膠相互作用的猝滅常數(shù) (Ksv)和速率常數(shù)(Kq)Table 1 The stern-volmer quenching constants and rate constants of gelatin quenched by RosA at different temperatures

    溫度/K猝滅常數(shù)Ksv×10-5/(L·moL-1)速率常數(shù)Kq×10-12/[L·(mol·s)-1]R22980.5775.770.997 93080.5335.330.991 03180.4954.950.993 1

    2.2 凝膠強度

    如圖3所示,當RosA質(zhì)量濃度為0.8 g/L時,凝膠強度無顯著性變化(p>0.05),隨著RosA質(zhì)量濃度繼續(xù)增大,明膠凝膠強度顯著增加(p<0.05),當濃度為5 g/L時,凝膠強度由459.547 g增至548.01 g,與GMEZESTACA等[10]研究結(jié)果一致。GMEZESTACA等[10]將迷迭香提取物加入到魚皮和牛皮明膠,凝膠強度都有顯著提高,這歸因于明膠與酚類物質(zhì)之間的非共價相互作用。RosA的添加可以增強明膠凝膠強度,可能是因為一分子RosA中含有的4個酚羥基和1個羧基,可能分別與明膠分子中N-H基團結(jié)合形成氫鍵,從而起到了明膠分子間“橋梁”的作用,增加了凝膠體系的緊密度,使得凝膠強度增加[19]。也就是說明膠與酚類之間的非共價作用在其中起到主導。KAEWDANG等[20]研究發(fā)現(xiàn),添加一定濃度的椰子殼提取物可以顯著提高金槍魚鰾明膠的凝膠強度,這是由于椰子殼中主要物質(zhì)是丹寧酸,丹寧酸與明膠之間主要通過氫鍵或疏水作用產(chǎn)生相互作用,有助于形成更強的凝膠網(wǎng)絡,使得凝膠強度增加,該結(jié)論與本研究分析一致。

    圖3 含有不同濃度RosA的明膠的凝膠強度Fig.3 Gel strength of gelatin incorporated with RosA at different concentrations

    2.3 流變性能

    如圖4所示,在凝膠體系下(低溫),RosA的添加可以增加明膠的G′和G″,但G′和G″隨RosA的添加量的增加變化趨勢不同,隨著RosA質(zhì)量濃度的增加,明膠樣品的G′呈先增加后下降的趨勢,G″呈現(xiàn)單純上升趨勢。MOHTAR等[6]研究表明將咖啡酸加入到魚皮明膠中,明膠樣品的G′隨著咖啡酸濃度的增加先升高后降低;GMEZESTACA等[10]研究表明將高濃度的迷迭香提取物加入到金槍魚皮明膠中,明膠樣品的G″有明顯提高,這是由于明膠部分肽鏈在形成凝膠過程中并沒有直接參與到蛋白凝膠基質(zhì)中,而是與酚類物質(zhì)之間發(fā)生了相互作用。這些均與本研究結(jié)果一致。

    這可能是因為當RosA添加量達到5 g/L時,由于大量的酚羥基和羧基造成了明膠鏈的凝聚,形成了明膠-RosA的絡合物,此時明膠凝膠的透明度降低可以說明這一推測的合理性。絡合物的形成可能影響了明膠分子形成類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成,從而降低了凝膠體系的彈性,造成G′的降低。但是由于RosA為連接的蛋白聚集體的大量存在,賦予了凝膠更好的黏性,使得G″進一步升高。

    圖4 含有不同濃度RosA明膠在升溫和降溫過程中的儲能模量和損耗模量的變化Fig.4 Evolution of G′ and G″ during heating and cooling processes of gelatin incorporated with RosA at different concentrations

    由圖5可知,RosA的加入并沒有顯著性地改變明膠樣品的的膠凝和熔化溫度,這說明明膠在形成凝膠和溶膠過程中,RosA并未參與類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成,GMEZESTACA等[10]將迷迭香提取物分別加入到魚皮和牛皮明膠中,發(fā)現(xiàn)明膠樣品的膠凝和熔化溫度并未發(fā)生顯著性變化,說明添加迷迭香提取物對明膠類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成只有微小干擾;GMEZGUILLéN等[21]將默塔葉提取物加入到魚皮明膠中也得到相似的結(jié)果,含有默塔葉提取物的明膠與單純明膠都具有相同的熔化溫度。此結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

    圖5 含有不同濃度RosA明膠的膠凝和熔化溫度Fig.5 Gelation and melting temperature of gelatin incorpo- rated with RosA at different concentrations

    2.4 凝膠電泳分析

    如圖6所示,不同的明膠樣品均含有明顯的β、α1和α2鏈,與對照相比,含有RosA的明膠樣品并無明顯區(qū)別,這是因為RosA與明膠之間主要是形成氫鍵等非共價作用,在電泳條件下,全部被SDS破壞。KAEWDANG等[21]將一定濃度的椰子殼提取物(主要物質(zhì)是丹寧酸)加入到金槍魚鰾明膠中,同樣發(fā)現(xiàn)電泳圖譜并無明顯區(qū)別,這是因為椰子殼提取物與魚鰾明膠之間主要發(fā)生氫鍵或疏水相互作用,SDS溶液能夠破壞這些弱鍵,使得圖譜沒有明顯差異。

    圖6 含有不同濃度RosA明膠的SDS電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE pattern of gelatin incorporated with RosA at different concentrations 注:M代表Maker,1,2,3,4,5分別代表迷迭香酸質(zhì)量濃度為 0、0.8、1.5、3、5 g/L。

    2.5 圓二色譜分析

    圓二色譜法可以有效測定蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)而廣泛應用于研究蛋白質(zhì)與小分子物質(zhì)之間的相互作用。研究表明[22],明膠通常在198 nm處有一負峰,在220 nm處有一正峰,不同的出峰位置可能與明膠的種類和提取方法有關(guān)。此外,在208 nm和222 nm處負特征峰與α螺旋結(jié)構(gòu)的存在有關(guān),在195 nm處正峰和216 nm處負峰與β折疊有關(guān)[23]。

    由圖7和表2可知,所有的明膠樣品均在210 nm和222 nm處有明顯的負峰和正峰,RosA的加入并沒有使明膠樣品的正負吸收峰位置發(fā)生偏移,但隨著RosA濃度的增加,吸收峰的強度在逐漸減少。

    圖7 含有不同濃度RosA明膠的圓二色譜圖Fig.7 CD spectra of gelatin incorporated with RosA at different concentrations 注:a-e分別代表RosA質(zhì)量濃度為0、0.8、1.5、3、5 g/L。

    RosA的加入使得α螺旋結(jié)構(gòu)部分解旋,α螺旋含量降低,β折疊含量升高,這可能是因為RosA的加入使得明膠肽鏈結(jié)構(gòu)部分展開。α螺旋主要靠分子內(nèi)的羰基氧和氨基氫之間形成的氫鍵維持穩(wěn)定[24], RosA含有的酚羥基和羧基與明膠的氨基之間形成新的氫鍵,進而破壞明膠原有的氫鍵平衡,從而導致α螺旋的解旋,同時伴隨著β折疊的形成。

    表2 含有不同濃度RosA明膠的二級結(jié)構(gòu)分析Table 2 Secondary structural analysis of gelatin incorpo- rated with RosA at different concentrations

    3 結(jié)論

    本研究分析了兔皮明膠與RosA之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)RosA能對明膠產(chǎn)生很強的猝滅效果,且猝滅機制為生成復合物的靜態(tài)猝滅。RosA可以提高明膠的凝膠強度,使明膠的黏性和彈性都有所增加,但對膠凝和熔化溫度沒有明顯影響,這可能是由于RosA與明膠之間通過氫鍵發(fā)生作用,并在明膠分子間起到“橋梁作用”,但對于明膠類三螺旋結(jié)構(gòu)的形成沒有明顯影響。SDS-PAGE結(jié)果也證實了經(jīng)過前處理后,RosA與明膠的相互作用全被破壞,使得電泳圖譜沒有明顯區(qū)別,說明它們之間相互作用為非共價作用。圓二色譜分析表明,隨著RosA的添加量增加,明膠結(jié)構(gòu)展開,α螺旋含量減少,β折疊含量增加。

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