基于生物條形碼結(jié)合雜交鏈式反應(yīng)雙重信號放大檢測蓖麻毒素

苑 帥 霍冰洋 張 曼 王 瑜 白家磊 彭 媛寧保安 陳 萍 高志賢*

1(吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院, 長春 130118)2(軍事科學院軍事醫(yī)學研究院環(huán)境醫(yī)學與作業(yè)醫(yī)學研究所,天津市環(huán)境與食品安全風險監(jiān)控技術(shù)重點實驗室, 天津 300050)

1 引 言

蓖麻毒素(Ricin toxin, RT)是從蓖麻種子中分離出來對真核細胞具有強烈毒性的蛋白, 是“化學武器公約”(CWC)附表1所列的唯一蛋白質(zhì)毒素[1]。蓖麻毒素由兩條多肽鏈RTA(約32 kDa)、RTB(約34 kDa)通過二硫鍵連接結(jié)合[2], 對人體具有很強的毒性, 通過呼吸、肌肉注射及皮膚接觸攝入均可造成染毒者死亡, 成人蓖麻毒素吸入及肌注的半數(shù)致死量(LD50)約為22 μg/kg, 口服LD50約為1 mg/kg, 屬于劇毒類毒素[3]。蓖麻毒素進入機體后, B鏈與細胞膜上的糖蛋白識別結(jié)合, 將A鏈送入細胞內(nèi)。A鏈每分鐘可失活近1500個核糖體, 強烈抑制蛋白質(zhì)的合成, 最終導致細胞及機體受損死亡[4]。蓖麻毒素由于其毒性強, 易于制備, 自然狀態(tài)下性質(zhì)穩(wěn)定的特點, 已有被用于威脅及暗殺的先例[5,6], 也極有可能被恐怖分子作為生物武器污染食品及水源, 威脅公共安全。因而, 無論從戰(zhàn)爭防護還是食品安全保障角度, 開發(fā)靈敏的蓖麻毒素檢測技術(shù)十分必要。

目前, 蓖麻毒素的主要檢測方法有免疫PCR技術(shù)[7]、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)[8]、上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析法[9]、質(zhì)譜檢測法[10,11]、表面增強拉曼檢測法[12]、適配體檢測法[13]、等離子體表面納米孔比色傳感器法[14]和表面等離子共振傳感器法[15]等。大部分檢測方法需要精密儀器, 檢測靈敏度高, 但檢測成本高; 近年開發(fā)的基于適配體的檢測方法, 相對而言成本較低, 但靈敏度受溫度、離子濃度等因素限制, 特異性及穩(wěn)定性不高; 免疫分析方法成本優(yōu)勢雖不及適配體檢測方法, 但成本低于大型儀器檢測方法, 且具有靈敏度高、選擇性好、穩(wěn)定性高等優(yōu)勢。

2003年, Mkrkin等[16,17]首先報道了生物條形碼(Bio-barcode assay)檢測方法用于檢測痕量蛋白或核酸, 在磁性微球上包被單抗制成磁探針(Magnetic microparticle, MMP), 納米金上標記多抗和條形碼DNA制成金探針(GNPs), 運用單多抗夾心靶標分子的原理, 納米金上連接的數(shù)百條DNA作為信號放大的工具。該方法具有非常高的靈敏度, 甚至可檢測到低至幾百個目標物分子的濃度[18,19]。但傳統(tǒng)的生物條形碼檢測方法使用的金標銀染法雖有很高的靈敏度, 但僅能進行定性分析[18]; 而熒光定量PCR法雖然能進行定量分析[20], 但需要大型的精密設(shè)備, 步驟復雜, 難以達到便攜、高效的要求。近年來, 核酸恒溫擴增技術(shù)的優(yōu)勢逐步顯現(xiàn), 它是繼PCR技術(shù)之后開發(fā)的新型擴增技術(shù), 具有快速、高效、特異性好且不需要變溫儀器設(shè)備支持等優(yōu)勢。其中, 雜交鏈式反應(yīng)(Hybridization chain reaction, HCR)在分析檢測方面得到了廣泛應(yīng)用[21～23]。該方法基于立足點(Toehold)的鏈置換的原理[24], 采用兩種可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈DNA探針, 兩種探針在頭部形成環(huán)狀區(qū)域, 中部堿基互補雜交形成莖部, 末端存在幾個堿基長的單鏈作為打開發(fā)卡的識別區(qū)。其環(huán)狀區(qū)域在解鏈后可與另外發(fā)夾的粘性末端雜交, 而正常狀態(tài)下不會發(fā)生雜交情況。當存在引發(fā)單鏈DNA時, 發(fā)卡H1的粘性末端識別并與之雜交, H1暴露出莖部的單鏈從而與發(fā)卡H2進行雜交, 這樣交互雜交形成帶缺口的長DNA結(jié)構(gòu), 理論上反應(yīng)一直可進行到發(fā)卡探針耗盡為止[25]。發(fā)卡探針上可標記熒光或生物素等, 可數(shù)十倍地放大信號。相比于其它擴增方法, HCR具有對反應(yīng)條件要求低、成本低、可任意編碼等優(yōu)勢[26]。

本研究結(jié)合生物條形碼及雜交鏈式反應(yīng)核酸信號放大優(yōu)勢, 開發(fā)了一種新型的靈敏檢測蓖麻毒素的方法。原理如圖1所示, 在黑色聚苯乙烯微孔板上包被抗蓖麻毒素單克隆抗體(mAb), 在蓖麻毒素目標物存在的條件下, 通過與吸附有多抗和連接條形碼DNA的金納米探針(GNPs)結(jié)合, 在微孔板底部形成mAb-Ricin-pAb/GNPs/Barcode DNA“三明治”夾心結(jié)構(gòu)。隨后加入生物素標記的發(fā)卡探針H1與H2, 修飾在金探針表面的條形碼DNA作為引發(fā)鏈引發(fā)H1和H2循環(huán)雜交擴增, 形成帶有許多生物素的長鏈DNA, 進一步加入辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(HRP-SA),與長鏈上的生物素結(jié)合, 在化學發(fā)光底物魯米諾與過氧化氫的存在下,利用化學發(fā)光進行檢測, 目標物蓖麻毒素含量越高, 對應(yīng)的化學發(fā)光值隨之升高。本方法結(jié)合了生物條形碼及雜交鏈式反應(yīng)的雙重優(yōu)勢, 經(jīng)過了兩次放大信號, 從而更大限度地提高了檢測靈敏度。

圖1 基于生物條形碼結(jié)合雜交鏈式反應(yīng)雙重信號放大檢測蓖麻毒素示意圖Fig.1 Schematic illustration of dual signal amplification based on bio-barcode combined with hybridization chain reaction (HCR) for detection of ricin toxin (RT)GNPs, gold nanoparticles; HRP, horseradish peroxidase; SA, streptavidin; mAb, monoclonal antibody

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

TGL-16C離心機(上海安亭科學儀器廠); HT7700 TEM 透射電子顯微鏡(日本日立公司); TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司); TGL-16M高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司); DYY-11型電泳儀(北京六一儀器廠); IQ350凝膠成像系統(tǒng)(美國GE公司); OSE-96干式恒溫金屬浴(北京天根生化科技有限公司); 渦旋振蕩器(德國IKA公司); 恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司); MP-180化學發(fā)光免疫分析儀(北京泰格科信生物科技有限公司)。

蓖麻毒素標準品(1.3 mg/mL)及蓖麻毒素多克隆抗體(北京翰譜生物醫(yī)藥研究所); 蓖麻毒素單克隆抗體(5.3 mg/mL, 美國GeneTex公司); 牛血清白蛋白(BSA, 美國Sigma-Aldrich公司); PBST緩沖液(含0.05%(V/V)Tween-20)、辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(HRP-SA, 1 mg/mL)、磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L PBS), 均購自北京索萊寶生物科技有限公司; 黑色聚苯乙烯微孔板、ECL化學發(fā)光底物液(美國Thermo Fisher Scientific公司)。緩沖液：鹽化緩沖液(1.37 mol/L NaCl, 0.01 mol/L PBS), 儲備緩沖液(1% PEG20000, 1% BSA, 0.01 mol/L PBS), 碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L, pH 9.6), 雜交緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, 0．4 mol/L NaCl, 5 mmol/L MgCl2, pH 7.5)。實驗用水為超純水(>18.0 MΩ cm)。所用核酸序列均由上海生工生物工程有限公司合成(經(jīng)HPLC純化), 核酸序列見表1。

表1 實驗所用核酸序列

Table 1 DNA sequences used in this study

名稱NameDNA序列(5'-3')DNA sequence (5'-3')條形碼DNA Barcode DNATTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGT AAAAA AAAAA-SH發(fā)卡探針H1 Hairpin H1ACCTCACTTCCGCGTATGGAGAAAGGTTAATTTCTCCATACGCGGAAG-Biotin發(fā)卡探針H2 Hairpin H2Biotin-TTTCTCCATACGCGGAAGTGAGGTCTTCCGCGTATGGAGAAATTAACC

核酸序列用雜交緩沖液溶解配制成10 μmol/L的儲備液, 使用前于95℃加熱5 min, 之后緩慢冷卻至室溫，備用。

2.2 實驗方法

2.2.1金納米探針的制備采用文獻[27]的方法合成15 nm的膠體金, 4℃避光備用。加入0.1 mol/L Na2CO3調(diào)節(jié)膠體金pH值(8.5～9.0)。取1 mL膠體金, 加入45 μg/mL蓖麻毒素多抗(pAb)100 μL, 室溫振蕩混勻1 h; 將條形碼DNA 4000 r/min離心30 s, 加入500 μL水溶解, 取100 μL條形碼DNA加至膠體金混合液中, 混勻后置于4℃結(jié)合2 h; 加入10% PEG 20000使終濃度為1%, 再加入鹽化緩沖液使其NaCl終濃度達到0.14 mol/L, 混勻后在4℃陳化2 h; 加入5% BSA使其終濃度達到1%(w/w), 4℃封閉1 h, 2000 r/min離心10 min, 棄沉淀, 13000 r/min離心20 min, 棄上清液, 加入1 mL儲備緩沖液吹打復溶沉淀, 13000 r/min離心20 min, 最后加入800 μL儲備緩沖液溶解金納米探針, 于4℃保存, 備用。

2.2.2膠體金最佳多抗標記量的確定依照膠體金探針標記蛋白穩(wěn)定化原理[28], 取膠體金溶液加入0.1 mol/L Na2CO3調(diào)整膠體金pH在8.5-9.0左右, 將使用0.01 mol/L PBS稀釋成不同濃度(0, 10, 20, 30, 40, 50 μg/mL,用PBS做空白)的單抗溶液分別取100 μL加入至1 mL上述膠體金溶液中, 室溫震蕩混勻1 h, 然后分別加入200 μL 10%(w/V) NaCl, 靜置2 h后, 測定524 nm處的吸收值

2.2.3瓊脂糖凝膠電泳取濃度為10 μmol/L的發(fā)卡探針H1和H2各10 μL混合, 分別加入不同濃度的條形碼引發(fā)鏈30 μL使其總濃度分別為0 μmol/L、0.125 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L和2 μmol/L, 用雜交緩沖液作空白, 室溫反應(yīng)雜交1 h。HCR反應(yīng)后，采用2%的瓊脂糖凝膠電泳, 80 V下電泳1.5 h。

2.2.4檢測方法的建立將蓖麻毒素單克隆抗體(1mg/mL)用CBS包被液按1∶2000稀釋, 每孔加入100 μL, 4℃包被過夜或37℃溫育2 h, PBST洗滌; 每孔加入120 μL 1% BSA, 37℃封閉1 h。每孔加入不同濃度的蓖麻毒素標準樣品溶液100 μL, 陰性孔不加入蓖麻毒素僅加入PBS, 37℃結(jié)合1 h。重復洗滌, 每孔加入金納米探針50 μL, 37℃孵育1 h。重復洗滌, 每孔加入發(fā)卡探針H1和H2各5 μL, 以及雜交緩沖液90 μL, 25℃下進行HCR雜交反應(yīng)1 h。棄去反應(yīng)液, 每孔加入PBS稀釋的HRP-SA(0.5μg/mL)100 μL, 37℃反應(yīng)25 min, PBST洗滌后, 將等體積的化學發(fā)光底物液混合, 每孔加入100 μL, 立即在化學發(fā)光免疫分析儀中測定相對光單位值(RLU)。

3 結(jié)果與討論

3.1 膠體金最佳多抗標記量的確定

圖2 不同濃度多抗標記膠體金的吸收光譜圖a, 50 μg/mL; b, 40 μg/mL; c, 30 μg/mL; d, 20 μg/mL; e, 10 μg/mL; f, 0 μg/mL; 插圖為524 nm處的吸光度值與濃度關(guān)系曲線Fig.2 Absorption spectra of labeling of GNPs with different concentrations of polyclonal antibody (pAb)a, 50μg/mL; b, 40 μg/mL; c, 30 μg/mL; d, 20 μg/mL; e, 10 μg/mL; f, 0 μg/mL. Inset shows absorbance at 524 nm versus concentration of pAb

制備的膠體金因帶有負電荷, 在堿性環(huán)境下大于蛋白等電點時會通過靜電吸附作用將多抗吸附到膠體金表面, 在NaCl存在下吸附在膠體金上的多抗阻止了膠體金顆粒的相互聚集。如圖2所示, 當多抗添加量小于40 μg/mL, 加入NaCl靜置后標記抗體的膠體金表面電荷受到破壞而相互聚集, 表現(xiàn)為520nm處附近吸收峰的降低; 當添加多抗的濃度大于40 μg/mL時, 吸光值變化趨于穩(wěn)定, 這是因為多抗充分吸附在膠體金表面, 電荷不會受到破壞, 達到穩(wěn)定狀態(tài), 因而在最低穩(wěn)定量基礎(chǔ)增加10%～20%為最佳添加量, 故選擇添加多抗的濃度為45 μg/mL。

3.2 金納米探針表征

TEM圖如圖3A所示, 采用檸檬酸鈉還原法合成的膠體金經(jīng)粒徑約為15 nm, 且粒徑均一; 圖3B所示膠體金的紫外最大吸收峰在520 nm處, 峰寬較窄, 說明粒徑均一化程度好, 吸附多抗和連接完條形碼DNA后的金納米探針最大吸收峰紅移至526 nm處, 間接證明金納米探針制備成功[29]。

圖3 (A)膠體金的透射電鏡圖(標尺為50 nm); (B)膠體金(曲線a)與金納米探針(曲線b)的吸收光譜Fig.3 (A) Transmission electron microscopic (TEM) image of bare GNPs; (B) Absorption spectra of unmodified GNPs (a) and pAb-GNPs-DNA complex (b)

3.3 瓊脂糖凝膠電泳表征

如圖4所示, 孔道3顯示當不存在條形碼DNA即引發(fā)鏈H0時, H1與H2能夠穩(wěn)定存在, 沒有發(fā)生擴增條帶, 在電泳圖上僅顯示一個條帶。當存在條形碼DNA作為引發(fā)鏈時, HCR發(fā)生擴增, 在不同濃度的引發(fā)鏈存在的條件下, 孔道4～8上均出現(xiàn)不同的彌散條帶, 而且隨著條形碼DNA濃度增高, DNA擴增的平均分子量降低, 這說明在發(fā)卡H1和H2濃度固定的條件下, 引發(fā)鏈濃度越高, 其打開發(fā)卡H1和H2的速率越快, 底物消耗過快, 使得形成長鏈DNA的平均分子量降低。

圖4 不同HCR擴增體系電泳圖(泳道1：H1 4 μmol/L; 泳道2：H2 4 μmol/L; 泳道3～8：6種不同濃度的H0 (0 μmol/L, 0.125 μmol/L, 0.25 μmol/L, 0.5 μmol/L, 1 μmol/L, 2 μmol/L) 在H1與H2均加入2 μmol/L的條件下, M分別為50 bp Marker與D2000 Marker)Fig.4 Electrophoretograms of different HCR amplification systems (lane 1: 4 μmol/L H1; lane 2: 4 μmol/L H2; lane 3-8: six different concentrations of H0 (0 μmol/L, 0.125 μmol/L, 0.25 μmol/L, 0.5 μ mol/L, 1 μmol/L, 2 μmol/L) in 2 μmol/L mixture of H1 and H2. M are two kinds of marker: 50 bp Marker and D2000 Marker)

3.4 可行性考察

采用本方法檢測兩種濃度的蓖麻毒素標樣, 如圖5所示, 加入蓖麻毒素后, 體系的RLU值顯著增大; 濃度越高, 對應(yīng)的RLU值越大, 且陰性值(0 ng/mL)較低, 說明蓖麻毒素可同時被單抗與金探針識別, 并引發(fā)HCR擴增, 放大信號, 證明本方法可用于不同濃度蓖麻毒素的測定。

圖5 利用本方法檢測不同濃度的蓖麻毒素的RLU值： a, 2 μg/mL; b, 200 ng/mL; c, 0 ng/mLFig.5 RLU of different concentrations of RT detected by this method. a, 2 μg/mL; b, 200 ng/mL; c, 0 ng/mL

3.5 實驗條件的優(yōu)化

分別考察了HCR雜交時間、HRP-SA結(jié)合時間及HRP-SA使用濃度對響應(yīng)信號的影響。由圖6A可知, 在HCR反應(yīng)前30 min內(nèi), RLU增加很快, 在30～45 min曲線逐漸趨于穩(wěn)定, 45 min后RLU趨于穩(wěn)定。表明在初始階段擴增, 發(fā)卡探針濃度很高, 因而反應(yīng)速率快; 隨著發(fā)卡探針不斷消耗, 45 min后RLU達到飽和，在體系中發(fā)生鏈置換的速度逐漸降低; 另外, 經(jīng)過大量雜交后的長鏈的整體熵自由能升高, 發(fā)卡探針的自由能不足以使其解鏈雜交, 從而使反應(yīng)逐漸停止。后續(xù)實驗選取45 min為HCR雜交擴增的最優(yōu)時間。圖6B為HCR反應(yīng)結(jié)束后加入HRP-SA孵育時間曲線, 在20 min后RLU趨于穩(wěn)定, 因而選取20 min為添加HRP-SA最佳結(jié)合時間。圖7的結(jié)果表明, 隨著HRP-SA濃度逐漸降低, 其陽性值與陰性值的比值呈先升高后降低的趨勢, 說明添加濃度過高會導致陰性微孔內(nèi)仍殘留HRP-SA, 使得陰性值升高; 濃度過低又會使長鏈上的生物素結(jié)合HRP-SA不完全, 使陽性值相對偏低。綜上, 選擇HRP-SA最佳濃度為0.5 μg/mL。

圖6 (A)HCR雜交時間及(B)HRP-SA孵育結(jié)合時間的優(yōu)化Fig.6 (A) Optimization of HCR hybridization time and (B) HRP-SA incubation binding time Concentration of RT is 50 μg/mL

3.6 方法分析性能

利用本方法檢測不同濃度的蓖麻毒素標準品。如圖8所示, 本方法線性范圍為0.61 ng/mL～5000 ng/mL, 對應(yīng)的兩段工作曲線為y1=0.90x+ 0.73(0.61～78.13 ng/mL,R2=0.998);y2=0.61x-0.88 (78.13～5000 ng/mL,R2=0.994), 檢出限為0.52 ng/mL(S/N=3)。另外, 使用雙抗夾心化學發(fā)光免疫檢測方法工作曲線如圖9所示, 其中酶標二抗按1∶10000倍稀釋加入, 其檢出限為即本方法的靈敏度是其78倍。說明HCR擴增能有效提高檢測靈敏度, 明顯高于常規(guī)化學發(fā)光免疫方法。本方法與其它檢測方法相比(表2), 具有檢測范圍寬、操作較簡單、靈敏度較高等優(yōu)勢。

選擇蓖麻毒素的結(jié)構(gòu)類似物相思子毒素(Arbin)、BSA、金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)及IgG作為對照物, 考察本方法的特異性, 結(jié)果如圖10所示。4種類似物均未對結(jié)果產(chǎn)生明顯影響, 這是由于本方法采用特異性單抗和多抗, 因而特異性和選擇性良好。

表2 蓖麻毒素檢測方法對比

Table 2 Comparison of methods for detection of RT

方法Method實驗時間Experiment duration檢出限LOD線性范圍Linear range文獻Reference酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA method10 h2 ng/mL1.2～10 ng/mL[8]表面增強拉曼檢測方法 SERS detection method2 h8.9 ng/mL10～500 ng/mL[12]適配體檢測方法 Aptamers detection method<3 h0.6 ng/mL0.75～100 ng/mL[13]等離子體表面納米孔比色傳感器法Plasmonic metasurfaces nanopin colorimetric sensor method10 min10 ng/mL10～120 ng/mL[14]表面等離子共振傳感器法 SPR sensor method<1 h3 ng/mL-[15]生物條形碼結(jié)合雜交鏈式反應(yīng)的化學發(fā)光法Chemiluminescent bio-barcode assay combined with HCR<7 h0.5 ng/mL0.61 ng/mL～5 μg/mL本方法This method

3.7 實際樣品分析及加標回收率測定

圖7 不同濃度的HRP-SA對檢測陽性(左)與陰性(右)樣品響應(yīng)信號值的影響, 插圖為對應(yīng)濃度的樣品的響應(yīng)與陰性樣品響應(yīng)的比值變化曲線Fig.7 Effect of different concentrations of HRP-SA on the positive (left) and negative (right) values, inset shows the ratio of the positive and negative values of the corresponding concentration a, 2 μg/mL; b, 1 μg/mL; c, 0.5 μg/mL; d, 0.25 μg/mL; e, 0.125 μg/mL; f, 0.0625 μg/mL

采用本方法檢測市售脫脂牛奶及飲用水樣品中的蓖麻毒素。脫脂牛奶首先在10000 r/min下離心20 min, 進一步除去上層脂肪，然后加入一定濃度的蓖麻毒素進行檢測，結(jié)果見表3。加標回收率在83.4%～112.4%之間, 相對標準偏差在2.2%～5.4%之間, 表明本方法靈敏度較高, 準確性較好, 可用于牛奶和飲用水實際中蓖麻毒素的檢測。

表3 牛奶和水樣中蓖麻毒素加標回收測定結(jié)果

Table 3 Recoveries of RT in milk and water samples (n=3)

樣品Sample加入量Added(ng/mL)檢出量Found(ng/mL)回收率Recovery(%)相對標準偏差RSD(%)飲用水Drinkingwater脫脂牛奶Skim mik2018.3191.65.25041.7083.43.410093.8293.83.2500532.1106.44.120002094104.72.22017.7588.84.45044.4388.95.410094.3594.42.4500517.2103.42.220002248112.43.2

圖8 檢測不同濃度范圍蓖麻毒素的工作曲線Fig.8 Linear calibration curves for detection of RT in different concentration ranges(A) 0.61-78.13 ng/mL, (B) 78.13-5000 ng/mL

圖9 雙抗夾心化學發(fā)光免疫法檢測蓖麻毒素的工作曲線Fig.9 Calibration curve of conventional chemiluminescence immunoassay for detection of RT

4 結(jié) 論

構(gòu)建了一種基于免疫生物條形碼及雜交鏈式反應(yīng)的化學發(fā)光傳感檢測方法, 其中膠體金表面修飾大量的條形碼DNA作為第一重信號放大, 進一步通過引入HCR恒溫擴增策略進行信號的二次放大。蓖麻毒素的檢出限為0.52 ng/mL, 用于脫脂牛奶及飲用水中蓖麻毒素的檢測, 效果良好。本方法操作簡單, 無酶擴增模式更有利于現(xiàn)場檢測; 同時, 本方法有效克服了傳統(tǒng)生物條形碼技術(shù)線性范圍較窄等不足。 本方法是DNA納米材料作為信號放大元件的條形碼檢測技術(shù)的進一步提升, 對于其它目標物的檢測具有一定的借鑒和參考價值。