“關(guān)-開”型近紅外熒光探針用于鐵離子和黑茶抗氧化活性測(cè)定

王貞睿 齊風(fēng)佩* 羅 苗 曹一鳴 劉洪濤蘇建科 張常青 龍立平 劉長輝*,2

1(湖南城市學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院, 黑茶金花湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，益陽 413000)2(湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410082)

1 引 言

鐵是生命體中不可或缺的微量元素之一，也是血紅蛋白、血紅素、多種酶和免疫系統(tǒng)的重要組成部分。鐵元素在質(zhì)子轉(zhuǎn)移、細(xì)胞新陳代謝、酶催化反應(yīng)及氧的運(yùn)輸與儲(chǔ)存等生理過程中發(fā)揮著重要的作用[1,2]。然而，人體內(nèi)鐵元素的缺乏會(huì)導(dǎo)致生理系統(tǒng)紊亂，而攝入過量的鐵也會(huì)誘發(fā)心臟病、貧血癥、糖尿病及腎衰竭等多種疾病，甚至死亡[3～5]。工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的鐵會(huì)造成環(huán)境污染，因此Fe3+的檢測(cè)對(duì)環(huán)境監(jiān)控及人類健康具有非常重要的意義。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的Fe3+檢測(cè)方法主要有比色法[6,7]、伏安法[8]和原子吸收光譜法[9]等。與上述檢測(cè)方法相比，熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、信號(hào)可調(diào)、廉價(jià)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)[10,11]。由于Fe3+的順磁性，鐵離子熒光探針大都屬于熒光淬滅型，易受其它淬滅過程的干擾，造成假“陽性”結(jié)果[12]。此外，大部分“關(guān)-開”型鐵離子熒光探針的發(fā)射光處在短波長區(qū)域，容易受到環(huán)境的影響[13～19]，而近紅外熒光探針具有背景干擾低、信噪比高等優(yōu)勢(shì)，可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度[15,16,20,21]。因此，發(fā)展高靈敏、高選擇性的熒光增強(qiáng)型近紅外熒光探針檢測(cè)Fe3+具有非常重要的意義。

茶葉中的黃酮、兒茶素等抗氧化性物質(zhì)能有效抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化活性[20]，其測(cè)定方法主要有清除自由基能力法[21]、氧化自由基吸收能力法[22]及鐵離子還原法[23]。其中，鐵離子還原法是基于Fe3+被還原為Fe2+后與三吡啶三嗪(TPTZ)絡(luò)合引起吸光度的變化來檢測(cè)抗氧化活性[23]。然而，分光光度法的靈敏度偏低。因此，開發(fā)高靈敏的分析方法檢測(cè)茶葉的抗氧化活性具有非常重要的意義。

圖1 CyQ-Cys探針的構(gòu)建及其對(duì)鐵離子的響應(yīng)機(jī)理Fig.1 Chemical construction of CyQ-Cys probe and fluorescent response towards Fe3+

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金屬離子可與生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)及半胱氨酸(Cys)分子中的羧基、氨基和巰基配位[17,24]，從而改變檢測(cè)體系的光學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子的檢測(cè)。本研究通過簡(jiǎn)單方法合成喹啉類花菁染料(CyQ)，利用鹵素-巰基的親核取代及重排反應(yīng)共價(jià)結(jié)合Cys[25,26]，進(jìn)一步合成了近紅外熒光探針(CyQ-Cys)，可高選擇性、快速識(shí)別Fe3+(見圖1)。同時(shí)，基于Fe3+介導(dǎo)的“關(guān)-開”策略，構(gòu)建了一種黑茶抗氧化活性檢測(cè)方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

F-4500熒光分光光度計(jì)、UV-3100 紫外-可見分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)； Varian INOVA400核磁共振儀(美國Varian公司)；HP1100LC/MSD質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)。

4-甲基喹啉、碘乙烷、金屬離子的高氯酸鹽均購自美國Sigma-Aldrich公司； 其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1化合物CyQ的制備參考文獻(xiàn)[27]方法，將0.432 g(2.5 mmol) 4-甲基-N-乙基喹啉、0.338 g(1.0 mmol)N-[(3-(苯胺基亞甲基)-2-氯-1-環(huán)己烯-1-基)亞甲基]苯胺鹽酸鹽及0.205 g(2.5 mmol)無水醋酸鈉溶于15 mL乙醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于80℃反應(yīng)1 h。冷卻后，旋蒸除溶劑，然后在氯仿/醋酸鈉溶液中攪拌1 h，過濾，真空干燥，柱層析分離(展開劑為甲醇/二氯甲烷，V/V，1:19)，得棕紅色固體0.286 g，產(chǎn)率47.2%。1H NMR (400 MHz, DMSO-D6)δ: 1.38( t, 3H), 1.52(t, 3H), 1.68(m, 2H), 2.76 (m, 4H), 4.58(q, 2H), 4.85(q, 2H), 5.45(d, 1H), 6.15(s, 1H), 6.52(d, 1H), 6.63(s, 1H), 6.72～7.30(m, 5H), 8.12～8.62(m, 6H), 9.85(d, 1H)。13C NMR (100 MHz, DMSO-D6)δ: 165.3, 146.8, 145.3, 144.0, 140.8, 139.3, 137.7, 136.2, 133.0, 130.4, 128.4, 126.1, 125.5, 124.8, 123.8, 118.6, 118.0, 116.1, 108.2, 58.6, 49.3, 30.3, 27.6, 25.1, 16.5, 14.3。 MS,m/z: 480.23[M]+, 理論計(jì)算值, 479.22。合成路線見圖2。

圖2 CyQ的合成路線Fig.2 Synthesis route of CyQ

2.2.2探針CyQ-Cys的制備化合物CyQ用DMF配成10 μmol/L溶液，Cys用水配成200 mmol/L溶液。將400 μL 10 μmol/L CyQ溶液、適量Cys溶液和5.0 μL PBS緩沖液(10 mmol/L，pH 7)混合均勻，用DMF稀釋至 500 μL。孵育3 min后，用熒光分光光度計(jì)記錄熒光信號(hào)的變化，激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度均為10 nm，電壓為 500 V，激發(fā)波長為460 nm，平行測(cè)試3次。

2.2.3選擇性實(shí)驗(yàn)金屬鹽用去離子水配成1.0 mmol/L溶液，備用。在熒光池中加入500 μL上述CyQ-Cys溶液，測(cè)其熒光發(fā)射光譜，然后加入不同金屬離子溶液，孵育3 min后，用熒光分光光度計(jì)記錄熒光信號(hào)變化，激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度均為10 nm，電壓為 500 V，激發(fā)波長為460 nm，平行測(cè)試3次。

2.2.4Fe3+的檢測(cè)在熒光池中加入500 μL上述CyQ-Cys溶液，測(cè)其熒光發(fā)射光譜，然后加入不同濃度的Fe3+溶液，用熒光分光光度計(jì)記錄熒光信號(hào)的變化，激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度均為10 nm，電壓為 500 V，激發(fā)波長為460 nm，平行測(cè)試3次。

2.2.5實(shí)際樣品的檢測(cè)準(zhǔn)確稱取10 g未處理的(毛茶)和發(fā)酵后的安化黑茶(金花黑茶)，于100 mL沸水中浸泡10 min。殘?jiān)偌臃兴?次，合并濾液，濃縮至50 mL，用去離子水定容至100 mL，備用。在熒光池中加入400 μL CyQ-Cys溶液和100 μL 黑茶備用液，測(cè)其熒光發(fā)射光譜，激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度均為10 nm，電壓為 500 V，激發(fā)波長為460 nm，平行測(cè)試3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針CyQ-Cys的構(gòu)建及光譜表征

根據(jù)生物硫醇可與金屬離子絡(luò)合的特性，利用巰基與鹵素之間的親核取代反應(yīng)和重排機(jī)制[25,26]，將化合物CyQ與Cys結(jié)合而構(gòu)建探針CyQ-Cys。如圖3A所示，隨著Cys濃度的增加，化合物CyQ的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，當(dāng)Cys濃度為110 μmol/L時(shí)，熒光猝滅最明顯，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此濃度。此外，研究了探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后的紫外-可見吸收光譜及熒光發(fā)射光譜的變化情況。如圖3B所示，探針CyQ-Cys在460 nm處產(chǎn)生強(qiáng)的吸收峰，與Fe3+作用后，吸收峰的強(qiáng)度明顯減弱。圖3C表明，探針CyQ-Cys與Fe3+作用后，在近紅外區(qū)662 nm處的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。光譜信號(hào)的變化說明，探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后展現(xiàn)了熒光的“關(guān)-開”過程，有利于Fe3+的熒光檢測(cè)。

圖3 (A) 化合物CyQ與Cys作用前后的熒光發(fā)射光譜; (B) 探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后的紫外-可見吸收光譜和(C)熒光發(fā)射光譜Fig.3 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ before and after addition of Cys; (B) UV-vis absorption spectra and (C) fluorescent emission spectra of CyQ-Cys before and after addition of Fe3+

3.2 pH值的影響

考慮到Cys的等電點(diǎn)為5.05，CyQ-Cys作為Fe3+的熒光探針主要基于Fe3+與羧基、氨基和巰基之間的配位作用，而溶液的pH值會(huì)改變氨基的存在方式，進(jìn)而改變CyQ與Cys的結(jié)合方式，從而影響CyQ-Cys的熒光響應(yīng)。探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后在662 nm 處的熒光強(qiáng)度與pH值關(guān)系曲線見圖4。如圖4A所示，在pH=7時(shí)，探針CyQ-Cys的熒光信號(hào)較弱，但Fe3+的加入顯著提高了體系的熒光強(qiáng)度。在pH 6.0～6.5范圍內(nèi)，Cys并不能有效淬滅化合物CyQ的熒光強(qiáng)度，盡管加入Fe3+后的熒光信號(hào)增強(qiáng)，但熒光強(qiáng)度的變化可以忽略不計(jì)；而pH=8.0時(shí)，探針Cys促使CyQ的熒光強(qiáng)度顯著減弱，但加入Fe3+并不能恢復(fù)體系的熒光信號(hào)?？赡苁窃谒嵝詶l件下，Cys分子中的氨基帶正電荷，難以競(jìng)爭(zhēng)取代巰基，導(dǎo)致熒光信號(hào)不易淬滅，而Fe3+會(huì)在堿性條件下形成Fe(OH)3，從而減少了其與探針CyQ-Cys的配位，阻礙了體系熒光信號(hào)的恢復(fù)。由圖4B可知，探針CyQ-Cys的熒光信號(hào)在30 min內(nèi)保持穩(wěn)定，且與Fe3+作用后的熒光信號(hào)也保持恒定，說明探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后均具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。因此，本方法可在pH=7的條件下檢測(cè)Fe3+含量。

圖4 (A) pH值對(duì)探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后的熒光強(qiáng)度(λem=662 nm)的影響; (B) 探針CyQ-Cys與Fe3+作用前后的穩(wěn)定性Fig.4 (A) Effect of pH value on fluorescent intensity of CyQ-Cys before and after treatment with Fe3+;(B) Stability of CyQ-Cys before and after treatment with Fe3+ (λem=662 nm)

3.3 動(dòng)力學(xué)過程

室溫下，固定pH=7，在探針CyQ-Cys的熒光信號(hào)趨于平穩(wěn)后加入Fe3+，進(jìn)一步考察了探針CyQ-Cys與Fe3+反應(yīng)過程中熒光發(fā)射光譜的變化。如圖5所示，在30～60 s內(nèi)，探針CyQ-Cys在662 nm處的熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)，大約20 s后熒光強(qiáng)度達(dá)到最大并基本保持穩(wěn)定，說明探針CyQ-Cys與Fe3+存在良好的絡(luò)合作用且反應(yīng)迅速，可用于對(duì)Fe3+的快速檢測(cè)。

圖5 探針CyQ-Cys與Fe3+作用的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 Kinetic curve of CyQ-Cys upon incubation with Fe3+ (λem=662 nm)

3.4 離子選擇性

為了驗(yàn)證探針CyQ-Cys對(duì)Fe3+的選擇性，選擇Fe3+及其它常見離子為識(shí)別對(duì)象，考察它們與CyQ-Cys作用前后熒光強(qiáng)度的變化。圖6A表明，Al3+、 Fe2+對(duì)CyQ-Cys熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)可以忽略不計(jì)，Cu2+、 Zn2+、 Hg2+、 Pb2+、 Mn2+、 Ag+、 Co2+等離子使體系的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步減弱，而Fe3+可顯著提高檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度，表明探針CyQ-Cys用于Fe3+檢測(cè)具有較好的特異性響應(yīng)。尤其是Fe3+與其它金屬離子共存時(shí)，如圖6B所示，探針CyQ-Cys對(duì)Fe3+仍顯示較強(qiáng)的抗干擾能力，說明探針CyQ-Cys是選擇性良好的熒光增強(qiáng)型Fe3+近紅外熒光探針。

圖6 (A) 探針CyQ-Cys與不同離子作用前后的熒光發(fā)射光譜，(B) 在干擾離子共存下，探針CyQ-Cys與Fe3+作用后的熒光強(qiáng)度變化。F0和F分別表示探針加入金屬離子前后在662 nm處的熒光強(qiáng)度，其中，1～10分別代表Cu2+、 Zn2+、 Hg2+、 Pb2+、 Mn2+、 Ag+、 Co2+、 Al3+、 Fe2+和Fe3+Fig.6 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ-Cys upon incubation with different ions; (B) Changes of fluorescent intensity of CyQ-Cys before and after addition of Fe3+. Inset, the number of 1 to 10 on behalf of Cu2+, Zn2+, Hg2+, Pb2+, Mn2+, Ag+, Co2+, Al3+, Fe2+ and Fe3+ respectively. F0 and F are fluorescent intensity of CyQ-Cys in the absence and presence of different metal ions, respectively (λem=662 nm)

3.5 Fe3+的檢測(cè)

為了考察不同濃度Fe3+存在時(shí)體系熒光強(qiáng)度的變化，在此檢測(cè)體系中加入不同濃度的Fe3+，測(cè)定相應(yīng)的熒光發(fā)射光譜如圖7所示。探針CyQ-Cys在662 nm處具有較弱的熒光信號(hào)，但隨著Fe3+濃度的增加，其熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且Fe3+在40 ～300 μmol/L的濃度范圍內(nèi)與探針CyQ-Cys的熒光強(qiáng)度變化呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y= 1.0619x+ 0.01355 (R2=0.9910)，檢出限為10.4 μmol/L (S/N=3)。

圖7 (A) 探針CyQ-Cys與不同濃度的Fe3+離子作用前后的熒光發(fā)射光譜；(B) 探針CyQ-Cys的熒光強(qiáng)度變化與Fe3+濃度的線性關(guān)系，F(xiàn)0和F分別表示探針CyQ-Cys加入Fe3+前后在662 nm處的熒光強(qiáng)度Fig.7 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ-Cys in the presence of different concentrations of Fe3+; (B) Plot of F/F0 versus Fe3+ concentration. F0 and F are fluorescent intensity of CyQ-Cys in the absence and presence of Fe3+, respectively (λem=662 nm)

3.6 識(shí)別機(jī)理研究

圖8 (A) 化合物CyQ與谷胱甘肽、半胱氨酸及N-乙?；腚装彼岱磻?yīng)的熒光發(fā)射光譜； (B) 探針CyQ-Cys與Fe3+的Job曲線Fig.8 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ upon incubation of Cys, N-acetylcysteine (NAC), and glutathione (GSH); (B) Plot of F/F0 versus concentration ratio of Fe3+ to CyQ-Cys. F0 and F are the fluorescent intensity of CyQ-Cys in the absence and presence of different Fe3+, respectively (λem=662 nm)

3.7 實(shí)際樣品中Fe3+檢測(cè)

以益陽資江河水為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)一步評(píng)價(jià)本方法檢測(cè)Fe3+的實(shí)用性，結(jié)果如表1所示，本方法檢測(cè)環(huán)境水樣中Fe3+的加標(biāo)回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差符合檢測(cè)要求，具有良好的應(yīng)用前景。尤其是Fe2+極易被氧化為Fe3+，因此，本方法可應(yīng)用于實(shí)際水樣中鐵含量的檢測(cè)。

表1 資江河水中Fe3+的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Determination of Fe3+in Zijiang river water samples

序號(hào)No.加入值A(chǔ)dded(μmol/L)測(cè)得值Found(μmol/L)回收率Recovery(%, n=3)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%, n=3)10.00.0—250.050.8101.61.33100.098.598. 62.04150.0151.2100.81.7

3.8 黑茶抗氧化活性檢測(cè)

參考鐵離子還原法[23]，以茶葉水提物為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)一步考察本方法檢測(cè)黑茶抗氧化活性的可行性，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度隨水提物體積分?jǐn)?shù)的增大而下降，熒光強(qiáng)度越弱，表明更多的Fe3+被還原為Fe2+，即體系的還原性越強(qiáng)。因此黑茶具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且金花黑茶的抗氧化活性高于毛茶。

表2 毛茶和金花黑茶的抗氧化活性

Table 2 Antioxidant capacity of raw tea and dark tea

序號(hào)No.水提物體積分?jǐn)?shù)Volume fraction ofaqueous extract(%)毛茶Raw tea(F/F0)黑茶 Dark tea(F/F0)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%, n=3)110.00.910.842.2230.00.850.722.8350.00.780.661.7

4 結(jié) 論

合成了喹啉基花菁類染料CyQ，利用其與Cys的鹵素-巰基親核取代反應(yīng)導(dǎo)致CyQ的熒光信號(hào)淬滅，構(gòu)建了一種近紅外熒光探針CyQ-Cys。根據(jù)Fe3+誘導(dǎo)CyQ-Cys體系的熒光強(qiáng)度明顯恢復(fù)，建立了一種Cys介導(dǎo)的“關(guān)-開”型近紅外熒光探針檢測(cè)Fe3+的方法。本方法具有合成簡(jiǎn)單、響應(yīng)速率快(< 30 s)、選擇性高及近紅外發(fā)射等優(yōu)勢(shì)，探針響應(yīng)不受其它金屬離子的干擾，并應(yīng)用于Fe3+快速檢測(cè)以及黑茶的抗氧化活性檢測(cè)。