重組酶聚合酶擴增技術的研究進展及其應用

杜亞楠，趙 笑，范小瑞，張 琪，趙 凱*，許 燕*

(1 上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海200234；2 上海市農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，上海201106；3 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海201106)

核酸體外擴增技術是生命科學研究中最常用的技術之一。聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，簡稱PCR)發(fā)明于1983年，目前已經(jīng)成為應用最為廣泛的核酸擴增技術[1]。該技術特異性強、靈敏度高，但需要昂貴的控溫循環(huán)儀，難以推廣到現(xiàn)場檢測。

近年來，隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，恒溫核酸擴增技術的出現(xiàn)解決了PCR技術在儀器上的局限性。該技術不需要溫度循環(huán)且反應更加快速，非常適用于資源有限地區(qū)的現(xiàn)場檢測[2]。目前已報道的的恒溫擴增技術有十幾種[3]。重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification，簡稱RPA)是一種由重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換Bsu聚合酶參與的恒溫擴增新技術[4]，可在23—45℃下連續(xù)進行反應，反應時間只需5—20min，特異性強、靈敏度高，非常適用于疾病診斷和現(xiàn)場檢測。本文對RPA技術的原理、特點、檢測方法進行詳細地介紹，并對其在病原體診斷、食品安全檢測、基因突變等方面的應用進展進行綜述。

1 早期恒溫擴增技術的缺點

20世紀以來，生物學家對生物復制機制的研究越來越深入，核酸體外擴增技術得到了快速發(fā)展，PCR技術不再唯一不可替代。目前已經(jīng)報道的恒溫擴增技術，除RPA技術以外，還包括環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)、依賴核酸序列的擴增技術(NASBA)和依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術(HDA)等。這3種恒溫擴增技術特異性強、靈敏度高，但在操作程序、反應溫度、反應時間和儀器要求等方面仍然存在各自的弊端(表1)。LAMP、NASBA和HAD雖然無需PCR儀等昂貴的熱循環(huán)儀，但都需要特定的加熱設備。LAMP和NASBA在檢測DNA時，都需要對模板進行95℃預變性處理，操作復雜。LAMP和HAD均需在65℃條件下進行退火，而且LAMP需要4—6條引物，設計復雜。另外，LAMP、NASBA和HAD反應時間至少需要60min?？傊?，LAMP、NASBA和HDA這3種恒溫擴增技術都需要特殊的儀器設備和較長的反應時間[5-7]。

表1 RPA技術與其他核酸擴增方法比較

注：*體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶可以擴增 RNA； GE：凝膠電泳；RT：實時熒光監(jiān)測；TE：濁度法；LFD：側(cè)流層析；SY：染料法

2 RPA技術的原理及特點

2.1 RPA技術的原理

RPA技術是由TwistDx生物技術公司發(fā)明的一種體外恒溫核酸擴增新技術。該技術主要模仿T4噬菌體內(nèi)的核酸復制機制[4]，依賴重組酶uvsX[8]和單鏈結(jié)合蛋白Gp32在體外恒溫條件下實現(xiàn)DNA模板的特異性識別與結(jié)合，并通過鏈置換DNA聚合酶Bsu實現(xiàn)模板DNA的擴增。

圖1 RPA技術的原理Fig.1 RPA technology principle

RPA技術的原理見圖1[9]。在ATP的參與下，重組酶uvsX與上游引物(或下游引物)相結(jié)合形成重組酶引物復合體，上游引物重組酶復合體能夠正向(下游引物重組酶復合體反向)掃描雙鏈DNA模板并識別與引物同源的靶序列，一旦找到，重組酶就可以使此位置的靶序列雙鏈DNA解鏈，并發(fā)生鏈置換反應，形成D形環(huán)結(jié)構(gòu)。這時，單鏈結(jié)合蛋白Gp32與被置換單鏈結(jié)合，防止置換的單鏈被進一步替換。與此同時，重組酶uvsX離開引物的3’端，鏈置換DNA聚合酶 Bsu與引物的3’端結(jié)合啟動鏈延伸，形成新的互補鏈。在這個過程中，上游引物和下游引物同時進行反應，最終產(chǎn)生一個完整的擴增子。合成的擴增子可以作為新的模板，最終實現(xiàn)DNA模板的指數(shù)擴增。在25—43℃[10,11]恒溫條件下，10min內(nèi)就可以獲得可檢出的擴增產(chǎn)物[12]。在RPA反應中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，就可以對 RNA模板進行一步法RT-RPA擴增[13]。

2.2 RPA引物設計

RPA技術的關鍵在于引物的設計。與傳統(tǒng)PCR引物不同，RPA的引物在設計時，一般以30—35 bp長度為宜。引物過短，會降低反應重組率；引物過長(45bp)，雖然可以使用，但易形成二級結(jié)構(gòu)。擴增片段最好控制在100—200 bp。其他設計規(guī)則可參考常規(guī)PCR引物設計[14]。RPA擴增產(chǎn)物長度的下限主要由RPA引物決定，通常擴增產(chǎn)物的長度不低于70bp。目前標準TwistAmp試劑盒只適用小于500bp的擴增子，對100—200bp的模板擴增效果最佳。如果需要設計探針，那么在設計擴增引物時應該留下足夠的空間。

2.3 RPA技術的優(yōu)點

(1)RPA技術在37—42℃恒溫條件下進行核酸擴增，既不需要PCR和LAMP中的預變性步驟，也不需要PCR中的熱循環(huán)及LAMP和HAD中65℃退火高溫步驟。這一特點使RPA操作更加簡單，無需熱循環(huán)儀器，減少了所需能量和成本。

(2)RPA反應非?？焖?，在5—20min就可以完成，遠遠快于PCR、LAMP、NASBA、HDA等技術。

(3)RPA可以進行多重反應，同時快速檢測多種樣品。

(4)RPA技術操作簡單，RPA TwistAmp?Basic 試劑盒的基礎反應體系含有 DNA 擴增所需的重組酶uvsX、單鏈結(jié)合蛋白Gp32、鏈置換DNA聚合酶Bsu和緩沖液，僅需在Basic 試劑盒的基礎反應體系中加入引物和模板即可反應[2]。 RPA反應可以與多種檢測方法結(jié)合，如與逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合可實現(xiàn)RT-RPA擴增，與探針結(jié)合可實現(xiàn)實時熒光定量 RPA、側(cè)流層析RPA等。

(5)RPA技術非常適用于現(xiàn)場樣品檢測。對檢測設備要求低，甚至可以利用人體體溫對樣品進行檢測；對檢測樣品要求低，只需要使用簡單的裂解液裂解1 min就可以用作模板，非常適合實地檢測。

(6)RPA技術的特異性很好，靈敏度高(1—10拷貝)[4,10]，可以與實時熒光定量PCR相媲美[15]。

2.4 RPA反應裝置的便攜化

RPA最佳反應溫度為37—42℃，因此其加熱設備能耗較低。近幾年，為了簡化RPA反應裝置，研究者嘗試利用物理或化學反應供熱[10,16]，但易受環(huán)境影響且需要良好的保溫設備。人體體溫為37℃左右，因此可以利用人體溫度孵育，手握或放于腋下。此方法非常適用于現(xiàn)場快速檢測。

雖然RPA技術可以恒溫反應，但該技術仍需要簡單的加熱設備。近年來，一系列一體化反應和檢測裝置陸續(xù)推出[17-18]。一體化反應裝置如Lutz等[17]設計的基于箔片的離心微流控芯片，內(nèi)含預存的液體和凍干粉反應試劑,以及一個可以在37℃孵育的實時熒光檢測裝置。一體化檢測裝置如全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置，將RPA反應與側(cè)流層析技術結(jié)合，在封閉條件下快速檢測擴增產(chǎn)物，非常方便，而且可以避免交叉污染[19]。

2.5 RPA技術的缺點

(1)RPA產(chǎn)物在進行瓊脂糖凝膠電泳檢測時，必須對產(chǎn)物進行純化，以避免產(chǎn)物以外其他成分造成的拖帶；(2)目前沒有專門的軟件能夠?qū)PA的引物和探針進行設計和篩選；(3)RPA技術所需要的引物和探針較長，無法對短序列核酸進行檢測；(4)反應溫度在37℃左右，反應時間短，在同時檢測大量樣品時，不易控制反應的同時進行。

2.6 RPA技術的成本分析

RPA商業(yè)化液體基本試劑盒的成本約為30元(人民幣，下同)反應，PCR的試劑成本大約1元反應，LAMP約3元反應。雖然RPA試劑成本較高，但RPA無需昂貴的PCR溫度循環(huán)儀，只需在常溫條件(37℃)下恒溫反應5—20min即可。Maria等[20]對RPA和PCR的試劑和時間成本分別進行了比較，發(fā)現(xiàn)RPA結(jié)合核酸粗提法與PCR的試劑成本相當，如果考慮時間成本，RPA每個反應的總成本比PCR要低得多。雖然LAMP也是恒溫反應，但仍然需要65℃退火60min，無法進行多重反應，其成本與RPA相比并沒有明顯的優(yōu)勢。

3 RPA產(chǎn)物的檢測方法

3.1 凝膠電泳檢測

RPA基礎反應體系除了需要添加重組酶uvsX、單鏈結(jié)合蛋白Gp32、DNA聚合酶Bsu外，其余成分與PCR相同。RPA的擴增產(chǎn)物也是DNA，可以用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。為了避免體系中其他成分對電泳的影響，產(chǎn)生拖帶，需要對擴增產(chǎn)物進行酚-氯仿抽提后進行瓊脂糖凝膠電泳，去掉引物、酶等干擾檢測的成分。經(jīng)過EB 染色，在紫外光下，通過凝膠成像儀對目的條帶進行檢測分析[4]；也可以用AxyPrep PCR清潔試劑盒對產(chǎn)物進行純化，效果比酚-氯仿抽提法更好。

3.2 實時熒光定量RPA

與RPA基礎反應體系相比，實時熒光定量RPA是通過加入一個核酸外切酶Ⅲ(exonuclease Ⅲ，即exo)和 exo 熒光探針(根據(jù)酶的名稱命名為 exo 探針)對模板擴增實現(xiàn)實時監(jiān)測。exo 熒光探針上有一個脫堿基位點類似物——四氫呋喃(THF)位點，在該位點兩側(cè)的胸腺嘧啶上分別標記一個熒光基團和一個淬滅基團，此時熒光強度很低。當探針與靶序列結(jié)合時，THF位點就會被核酸外切酶Ⅲ識別并酶解，將熒光基團與淬滅基團分開，使熒光基團熒光強度增強，以此實現(xiàn)模板擴增過程的實時監(jiān)測。TwistAmp exo探針法就是根據(jù)這個原理設計的。使用便攜式熒光檢測儀(Twista，TwistDX，Cambridge，UK )可在10—20min內(nèi)檢測到熒光曲線，其靈敏度可達到1—10拷貝[4,10]。

3.3 側(cè)流層析(RPA-LFD)檢測

RPA-LFD方法是在RPA基礎反應體系中加入核酸外切酶Ⅳ(endonuclease Ⅳ，即nfo)、nfo探針(根據(jù)酶的名稱命名為 nfo 探針)和反向引物(標記生物素或地高辛)。nfo探針也有一個THF位點，其5’端帶有熒光基團，3’端帶有阻斷物。其原理是核酸擴增產(chǎn)物被生物素標記后可以和FAM熒光基團標記的特異性探針雜交。核酸外切酶Ⅳ可以識別并切開nfo探針的THF位點，產(chǎn)生自由的羥基端與DNA聚合酶結(jié)合啟動延伸過程。最終形成的FAM和生物素雙標記的擴增產(chǎn)物，可以使用側(cè)流層析法如“夾心法”的側(cè)流試紙條進行檢測。

側(cè)流試紙條上有一條檢測線和一條質(zhì)控線，檢測線上含有生物素抗體，對照線上含有固定抗體。其原理是擴增子的FAM與抗FAM抗體的金標物結(jié)合后，形成免疫復合物。免疫復合物在試紙條上會進行層析擴散。檢測線上的生物素配體可以捕獲含有生物素擴增子的免疫復合物并顯色。不含生物素的免疫復合物繼續(xù)擴散，被質(zhì)控線上的固定抗體捕獲，形成具有顏色的質(zhì)控線。LF-RPA在37—39℃下，一般5—15min便可通過肉眼觀察檢測線和質(zhì)控線的顏色來判斷檢測結(jié)果，適用于現(xiàn)場簡單快速檢測[18]。RPA的產(chǎn)物需要稀釋才能使用該方法檢測，避免反應底物對試紙上抗體的干擾。

3.4 染料法檢測

染料法是使用SYBR GreenⅠ染料對RPA產(chǎn)生的DNA雙鏈進行染色，以此實現(xiàn)對結(jié)果的可視化觀察。擴增產(chǎn)物雙倍稀釋后，在微型紫外手電筒的幫助下，就可以通過肉眼觀察結(jié)果。陰性樣品保持無色，陽性樣品變?yōu)闊晒饩G色。RPA與染料法結(jié)合的方法利用人體體溫就可以完成反應，只需10 min即可完成樣品的檢測過程，因此RPA與染料法結(jié)合的方法非常適用于樣品的現(xiàn)場檢測[12]。

3.5 RPA-ELISA

RPA-ELISA技術是將RPA技術與ELISA技術相結(jié)合，將標記的產(chǎn)物與微量滴定板中的5’-生物素化探針(或鏈霉素親和素)進行雜交，用比色免疫分析法進行擴增產(chǎn)物分析。RPA-ELISA技術不需要熱循環(huán)，為常規(guī)應用提供了一種靈敏、特異和經(jīng)濟的方法，在資源有限的環(huán)境中非常有效[21]。

4 RPA技術的應用

4.1 RPA在病毒檢測上的應用

Rohrman等[18]應用RPA-LFD技術快速檢測HIV，并成功應用此方法檢測干血漬中提取的DNA，非常適用于HIV的現(xiàn)場快速檢測。Wahed等[22]將RT-RPA技術應用于手足口病病毒(FMDV)的快速診斷。在埃及2013年的FMDV爆發(fā)中，該技術被成功應用于現(xiàn)場FMDV的快速檢測和疫情控制。Euler等[23]研發(fā)的RPA檢測板可以在6—10min內(nèi)同時檢測多種病毒，包括埃博拉病毒、馬爾堡病毒、裂谷熱病毒、蘇丹病毒和天花病毒。該方法特異性強，與人類基因組無交叉反應，檢測多種病毒的靈敏度較高，為16拷貝。RPA在植物病毒中的應用也越來越多，Londoo等[20]采用改進的RPA方法檢測菜豆金黃花葉病毒屬的3種病毒。該方法采用0.5 molL NaOH粗提法獲取菜豆黃色花葉病毒、番茄斑點病毒和番茄黃葉卷曲病毒DNA的粗提液，直接用于RPA檢測。試驗證明RPA檢測這3種病毒具有特異性，而PCR不能夠檢測到粗提液中的DNA病毒。此外，RPA還被應用于玫瑰叢簇病毒、犬細小病毒、腺病毒、黑蜂王臺病毒、對蝦WSSV和IHHNV病毒等動植物病毒的檢測。

4.2 RPA在細菌檢測上的應用

2010年，Lutz等[17]最早將RPA與基于鉑片的離心微流控盒相結(jié)合，對金黃色葡萄球菌的耐藥基因(mecA)進行全自動分析，可在20min內(nèi)檢測低至10拷貝的DNA。2014年，Boyle等[9]應用實時熒光定量RPA檢測結(jié)核分枝桿菌復合群(MTC)的DNA。該方法可以在20min內(nèi)檢測到低至 6.25 fg的DNA模板，其準確性也遠遠大于熒光顯微鏡檢測。2017年，Kim等[24]應用RPA方法在10min內(nèi)就可以直接特異地檢測到雞蛋和雞肉中的沙門氏菌，靈敏度是實時熒光定量PCR方法的100倍。在病毒檢測中提到的RPA檢測板[23]不僅能檢測多種病毒，還能同時檢測炭疽桿菌、鼠疫耶爾森菌和土拉弗朗西斯菌，顯示出RPA在多重檢測方面的巨大潛力。

4.3 RPA在寄生蟲檢測上的應用

2014年，Kersting等[25]采用RPA-LFD技術檢測惡性瘧原蟲，具有較高的特異性和靈敏度，只需38℃恒溫反應10min，非常適合現(xiàn)場檢測。2015年，Crannell等[26]應用同樣的方法快速檢測糞便中賈第鞭毛蟲的DNA。在從秘魯收集的10 000份糞便樣品中，使用RPA技術與PCR、顯微鏡分別進行復合檢測，顯示出73%的靈敏度和95%的特異性。同年Crannell等[27]還進一步開發(fā)了多重RPA-LFD方法，同時檢測隱孢子蟲、阿米巴蟲和賈第鞭毛蟲，檢測限分別為每個反應446條、449條和444條寄生蟲。目前還開發(fā)了日本血吸蟲、環(huán)形泰勒蟲、伯氏螺旋體和剛地弓形蟲側(cè)流層析試紙條，特異性好、靈敏度高，非常適合現(xiàn)場寄生蟲檢測。

4.4 RPA在單堿基突變檢測上的應用

Gootenberg等[28]將一種靶向RNA的相關酶Cas13a與RPA結(jié)合應用于即時病原體診斷、基因型分析和疾病監(jiān)測。其原理是Cas13a能夠?qū)δ繕薘NA進行切割，也不會失去活性，而且可以通過 “附帶切割”切割其他的非靶RNA。這種技術也被稱為“SHERLOCK”。由于SHERLOCK試劑可以以凍干粉的形式長期儲存，再結(jié)合基于試紙條的檢測方法，非常適合于在資源有限地區(qū)的疾病現(xiàn)場診斷。Shin 等[29]將RPA與等溫固相擴增檢測(ISAD)技術結(jié)合快速檢測癌癥單堿基突變。Martorell等[30]開發(fā)了一種阻斷RPA結(jié)合芯片雜交技術檢測PIK3CA基因中的突變，如p.E545K和p.H1047L。該技術主要利用一段阻斷的寡核苷酸(3’末端的雙脫氧胞苷)。該寡核苷酸與野生型基因目標位點可以結(jié)合，而與突變基因不結(jié)合，從而減少野生型基因被擴增的比例，使突變基因更容易被檢測。采用比色法能夠在高達95%的野生型DNA的情況下有效地區(qū)分PIK3CA基因中的突變，如p.E545K和p.H1047L。該方法已成功用于各種癌細胞系以及腫瘤組織的基因分型。

4.5 RPA在食品安全上的應用

吳建等[12]應用RPA技術檢測轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2，使用熒光染料實現(xiàn)反應結(jié)果的可視化，結(jié)合簡單的樣品制備，整個檢測過程在10 min內(nèi)就可以完成。Santiago等[21]將RPA技術與ELISA技術結(jié)合起來，應用于食品安全方面的檢測，如過敏原(榛子、花生、大豆、番茄和玉米)、轉(zhuǎn)基因植物(P35S和TNOS)、食源性致病菌和真菌的檢測。RPA-ELISA具有反應迅速、操作簡便、環(huán)境要求低等優(yōu)勢，非常適合食品現(xiàn)場快速檢測以及在基層推廣應用。本實驗室應用實時熒光定量RPA技術檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt11中外源基因的nos終止子，測得其相對檢測限約為0.1%，遠低于歐盟國家設定的轉(zhuǎn)基因最低限量(0.9%)，靈敏度較高，絕對檢測限約為50拷貝。目前，本實驗室正在進行RPA和RT-RPA結(jié)合凝膠電泳法和染料法，在植物病毒和轉(zhuǎn)基因植物檢測方面進行研究。

5 展望

雖然RPA技術出現(xiàn)的時間并不長，但是它具有反應時間短、高靈敏度等優(yōu)越性，引起了生物學家的廣泛關注。該技術目前與電泳法、探針法、側(cè)流層析法、染色法、ELISA等方法已廣泛應用于病原體診斷、食品安全檢測及基因突變等方面。但RPA技術需要較長的引物和探針，而且目前沒有專業(yè)的軟件可以進行RPA引物設計，主要靠大量合成與篩選。但是其低溫、恒溫和反應快速的優(yōu)點使它被看做是可以替代甚至超越PCR的核酸擴增技術。

隨著對RPA技術研究的深入，可以對RPA基礎反應體系基本成分進行進一步探究，尋找重組酶聚合酶的替代品，降低成本。在反應溫度方面，雖然是37—42℃恒溫反應，但是也需要簡單的加熱設備。可以通過進一步的研究，在不影響其特異性、靈敏度和反應速度的基礎上，拓寬反應的溫度范圍，結(jié)合集核酸簡單抽提、反應、檢測一體化裝置的研究，使其更加完善，更好地應用于生命科學的各個領域。