前庭代償動物模型方法綜述

黃青 尹時華

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧530007)

前庭系統(tǒng)是人體重要的平衡系統(tǒng)，有助于姿勢反射和眼動反射的產(chǎn)生，且與空間知覺、空間方向、本體感覺等高級認(rèn)知過程有關(guān)[1]。由于衰老，頭部創(chuàng)傷，耳毒性藥物或前庭病變導(dǎo)致的前庭傳入改變會對平衡控制和凝視穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，這兩種功能受損會對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生重大影響。前庭損傷患者除了眩暈、頭暈及與之相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)癥狀惡心、嘔吐，還有與健康人相比更多的焦慮和抑郁，飽受身體、心理的雙重打擊，患者常出現(xiàn)停職、社會孤立等嚴(yán)重社會行為障礙[2]。

雖然，眩暈、眼震、平衡障礙等急性前庭綜合征在動物和人體中均可通過前庭代償在數(shù)星期或數(shù)月得到改善[1]。但前庭系統(tǒng)損傷后的恢復(fù)時間（數(shù)日到數(shù)月不等）和最終恢復(fù)水平（癥狀緩解或消失）都有極大的個體差異，而且內(nèi)耳前庭的病變大多為不可逆性損害，前庭癥狀卻能隨著時間逐漸緩解或消失，這里涉及許多復(fù)雜的機制。有研究認(rèn)為，兩側(cè)前庭神經(jīng)核之間的聯(lián)合纖維在代償中有新的突觸產(chǎn)生，也有認(rèn)為參與維持機體平衡的其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)（視覺、小腦、大腦、本體感覺）進行相應(yīng)調(diào)整以彌補兩側(cè)前庭神經(jīng)的不均等傳入，但目前其機制還不是十分清楚。因受臨床倫理限制，建立合適的動物模型成為研究其機制的重要手段。目前主要的建模方式有：手術(shù)切除、化學(xué)性迷路破壞、手術(shù)+化學(xué)方法破壞迷路及空氣注射（見表1）。經(jīng)國內(nèi)外研究者幾十年的努力，已取得了一些成果，但還遠遠不夠，明確前庭的自發(fā)功能恢復(fù)機制、研究損傷后神經(jīng)和行為的可塑性，進而把握神經(jīng)可塑性改變的最佳時間窗并指導(dǎo)臨床前庭康復(fù)治療仍然任重而道遠，建立相似性高、重復(fù)性好的動物模型十分必要。本文現(xiàn)將目前存在的前庭代償動物模型建立方法進行綜述，為前庭代償機制、中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性研究提供基礎(chǔ)條件。

1 手術(shù)切除動物模型

1.1 單側(cè)迷路切除術(shù)（unilaterallabyrinthectomy,UL）

青蛙的迷路器官由三個半規(guī)管（外、前、后）、三個黃斑部、兩個乳突組成。1995年N.DIERINGER[3]通過上顎經(jīng)腹側(cè)入路打開青蛙聽泡，去除一側(cè)所有迷路器官、神經(jīng)節(jié)前分支，建立迷路部分切除模型，術(shù)后表現(xiàn)出嚴(yán)重的姿勢紊亂，但沒有自發(fā)性眼球震顫，之后2個月體位逐漸恢復(fù)正常。青蛙因較哺乳動物簡單的神經(jīng)組織和少的行為自由度且腦組織可在體外培養(yǎng)，而更有利于研究前庭代償，但物種的特殊性使其只能解釋部分行為恢復(fù)情況，具有局限性。2014年HH Lee等[4]通過對大鼠行UL，建立了前庭代償模型，具體方法：大鼠麻醉后做耳后緣切口，切除鼓膜和聽小骨，在前庭側(cè)壁上造孔，擴大穿孔到完全打開前庭外側(cè)壁，吸出外淋巴液，直到不再漏出，最后用膠原填充內(nèi)腔，縫合肌肉、皮膚。研究還證實了鼓室內(nèi)注射濃度大于4%的利多卡因可誘發(fā)注射耳前庭反射減退。此模型運用時間較長，可靠性高、相對簡單，且實驗對象廣泛，是比較經(jīng)典的手術(shù)，但缺點在于手術(shù)破壞大，致死率高。

1.2 單側(cè)前庭傳入神經(jīng)阻滯術(shù)（unilateral vestibular deafferentation,UVD）

2003年Catherine M.Gliddon等[5]運用UVD建立豚鼠前庭代償模型，并研究證實了UVD后的眼動和體位綜合征可激活下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA）軸，推測HPA軸激活程度的差異可能導(dǎo)致前庭癥狀嚴(yán)重程度和靜態(tài)補償時間過程的變化。Libby Lindsay等[6]于2005年通過大鼠耳后入路UVD，建立了前庭代償模型，具體方法：大鼠麻醉后行耳后切口，打開內(nèi)聽道，在兩處燒灼鐙骨動脈，鉆開耳蝸的球囊、橢圓囊和半規(guī)管壺腹，吸出內(nèi)容物，封閉開口。這種UVD術(shù)式可以產(chǎn)生完整的前庭迷路損傷，先前的研究也表明，其產(chǎn)生的行為癥狀（劇烈的眼震和嚴(yán)重的體位不對稱）與其它方法相同[7-10]。同年，RONG ZHANG等[11]運用上述方法，建立大鼠前庭代償模型，證實了前庭補償過程中，前庭內(nèi)側(cè)核中表達胞質(zhì)糖皮質(zhì)激素受體的神經(jīng)元數(shù)量、血皮質(zhì)酮水平均未發(fā)生顯著變化。此模型優(yōu)點在于造模成功率高，可產(chǎn)生完整的迷路損傷，缺點在于損傷大，動物術(shù)后易感染。

1.3 單側(cè)前庭神經(jīng)切斷術(shù)（unilateral vestibular neurotomy,UVN）

1976年M.LACOUR等[12]用狒狒作為實驗對象，經(jīng)顱中窩手術(shù)暴露內(nèi)聽道，切斷前庭神經(jīng)，建立前庭代償模型，證明了積極的感覺運動探索引發(fā)的本體感受性肌肉和關(guān)節(jié)傳入對前庭恢復(fù)具有重要作用。由UVN引起的姿勢、眼運動、感知和神經(jīng)系統(tǒng)綜合征可產(chǎn)生應(yīng)激，從而激活HPA軸[5,13]。2009年B.TIGHILET等[13]行UVN建立貓前庭代償模型，具體方法：貓麻醉后行左乳突切開，破壞骨迷路，暴露內(nèi)聽道，在神經(jīng)節(jié)后水平切斷前庭神經(jīng)。術(shù)后表現(xiàn)出經(jīng)典姿勢、運動和眼動缺陷，可作為判定前庭神經(jīng)損害的標(biāo)準(zhǔn)。且這種造模方法產(chǎn)生的單側(cè)前庭神經(jīng)傳入阻滯的完整性在之前的組織學(xué)研究中已得到證實[12]。2017年David Péricat等[14]行一側(cè)鼓室入路建立新的大鼠UVN后前庭代償模型，方法：大鼠麻醉后解剖分離到鼓室，鉆孔暴露鐙骨動脈和含耳蝸的隆突，分離隆突并暴露耳蝸，隨后切除耳蝸骨性部分顯露耳蝸神經(jīng)，修剪擴大耳蝸神經(jīng)管，然后抽吸第八顱神經(jīng)（前庭蝸神經(jīng)），在靠近腦干處切斷整根神經(jīng)，閉合切口。所有動物醒來均出現(xiàn)前庭綜合征，包括翻滾行為和自發(fā)性眼震。研究證實這是一種新的能導(dǎo)致完全性、不可逆性單側(cè)前庭損傷的大鼠模型。這個模型特別適合研究外周傳入神經(jīng)去除后前庭功能恢復(fù)動力學(xué)、中樞代償過程中的神經(jīng)化學(xué)和分子機制，也可用于檢查抗眩暈藥的療效。優(yōu)點在于能誘導(dǎo)前庭完全損傷，其局限性在于需要比UL更多的手術(shù)技巧和時間，且可能導(dǎo)致腦損傷[15]。

2 化學(xué)性迷路破壞動物模型

2.1 氯仿注射法

2.1.1 氯仿+凡士林油注射法

1982年LAURA PETROSINI等[16]將氯仿和凡士林油溶液注入豚鼠右側(cè)中耳破壞迷路，建立前庭代償動物模型，并證明了乙醇對早期前庭損傷后的恢復(fù)有加速作用。1983年P(guān)etrosini L等[17]運用同樣的方法，建立了化學(xué)性單側(cè)迷路破壞后前庭代償豚鼠模型，并證實傳遞外周和本體感受信息到前庭核的上行脊髓通路的普遍激活，有利于迷路切除后重新獲得眼和體位的平衡。

2.1.2 氯仿+石蠟油注射法

1997年馮勃等[18]在直視下通過鼓膜向豚鼠一側(cè)中耳注射氯仿和石蠟油混合液，建立化學(xué)性迷路破壞后前庭代償動物模型，證實了在迷路破壞后的48小時，自發(fā)性眼震的頻率、慢相角速度和頭偏斜及失衡行為得分都出現(xiàn)特征性下降的過程。

2.1.3 單純氯仿注射法

2009年Ishikawa K等[19]在顯微鏡下向豚鼠左中耳注射氯仿破壞迷路，建立前庭代償動物模型，證明了視覺傳入具有方向選擇性，當(dāng)一側(cè)迷路破壞時損傷側(cè)的視覺傳入作為視覺補償極為重要。

向中耳鼓室注射氯仿，是一種操作簡單且經(jīng)濟的化學(xué)性迷路破壞術(shù)，可用于外周前庭損傷后的中樞代償機制研究。有學(xué)者認(rèn)為[20]，氯仿對內(nèi)耳具有毒性作用，不能導(dǎo)致迷路破壞，但馮勃等認(rèn)為注射氯仿后48小時，壺腹嵴毛細胞、球囊及橢圓囊斑輪廓可見，纖毛不完整，冰水試驗沒有反應(yīng)，再次注射氯仿沒有出現(xiàn)迷路破壞的典型癥狀，說明前庭功能此時已喪失，注射氯仿后1周及1個月，壺腹嵴毛細胞、囊斑境界不清，嵴帽、纖毛消失，證實了氯仿的化學(xué)性迷路切除作用。當(dāng)然，氯仿對內(nèi)耳的損傷有待進一步研究其超微結(jié)構(gòu)改變及機制[21]。此模型的優(yōu)點在于操作簡單、經(jīng)濟并且能產(chǎn)生可靠的結(jié)果，缺點是氯仿具有耳毒性，耳蝸可能受損，并隨時間發(fā)生前庭損害。

2.2 對阿散酸及阿散酸鈉注射法

2014年Roswitha Beck等[22]通過鼓室內(nèi)注入對阿散酸建立了大鼠化學(xué)性單側(cè)迷路破壞模型，具體方法：大鼠麻醉后行左旁正中切口，經(jīng)鼓膜向鼓室注入布比卡因溶液，1分鐘后吸出，再滴注，重復(fù)3次，隨后注入對阿散酸溶液，徹底抽吸，縫合皮膚。術(shù)后所有動物均表現(xiàn)出急性前庭癥狀：眼球震顫和姿勢不穩(wěn)，這些癥狀可隨時間逐漸緩解，進一步證明模型建造成功。2016年Andreas Zwergal等[23]用如上相同的方法建立了大鼠前庭代償模型，證實了大鼠在造模后行為恢復(fù)過程（前庭代償）中腦葡萄糖代謝的動態(tài)變化。同年，Moslem Shaabani等[24]向大鼠一側(cè)鼓室注射阿散酸鈉，建立單側(cè)迷路破壞動物模型，并證實了前庭電刺激在加速靜態(tài)和動態(tài)前庭代償方面的有效性，提出其可作為單側(cè)前庭損傷患者的康復(fù)治療。

以往的研究也表明，鼓室內(nèi)注射阿散酸鈉對誘發(fā)大鼠單側(cè)或雙側(cè)化學(xué)性迷路切除有很好的效果[25-27]，由此引起的靜態(tài)（姿勢）和動態(tài)癥狀（運動）分別在術(shù)后36天、42天恢復(fù)，故此建模方法可為前庭代償方面的實驗研究提供長期、可靠的模型，但缺點是阿散酸誘導(dǎo)的毒性可能損害突觸聯(lián)系，且損害是不可逆的，也可能會扭曲同側(cè)前庭核的電生理輸入[24]。

2.3 河豚毒素注射法

河豚毒素常被用來短暫性阻斷動作電位并封閉前庭神經(jīng)[28,29]。2011 年 Sophie Dutheil等[30]在手術(shù)顯微鏡下暴露貓左鼓室的圓窗及卵圓窗，注入河豚毒素引起前庭傳入神經(jīng)阻滯，建立前庭代償動物模型。研究通過比較UVN、UL、單側(cè)注射河豚毒素三種建模方法，證實前庭神經(jīng)核只在急性和完全前庭損傷(UVN)后表現(xiàn)神經(jīng)性潛能，前庭傳入神經(jīng)阻滯較輕微（UL，河豚毒素注射）時，表現(xiàn)非結(jié)構(gòu)性可塑性過程。此模型受河豚毒素劑量的影響較大，可逆阻斷前庭神經(jīng)傳入，模型不穩(wěn)定。

3 手術(shù)+化學(xué)方法破壞迷路動物模型

3.1 UVD+乙醇化學(xué)破壞

2004年Arata Horii等[31]通過UVD+乙醇化學(xué)破壞迷路，建立大鼠前庭代償模型，方法：大鼠麻醉后行耳后入路，依次去除鼓膜、錘骨、砧骨，從鉆孔的前庭和卵圓窗腹側(cè)吸出迷路液，乙醇沖洗迷路，并證實了UVD后6小時（術(shù)后檢測時間依據(jù)既往大鼠行為補償數(shù)據(jù)∶UVD后6 h為急性期，自發(fā)性眼球震顫劇烈、頭部傾斜嚴(yán)重，屬于未代償階段[32,33]）雙側(cè)前庭核復(fù)合體基因的不對稱表達。此模型造模成功率高，迷路破壞完整，但手術(shù)創(chuàng)傷性大，動物易感染致死。

3.2 UL+氯仿化學(xué)破壞

2006年張亞民等[34]通過手術(shù)加氯仿破壞迷路，建立了大鼠前庭代償模型，方法：大鼠麻醉后做耳后切口，依次打開聽泡、前庭，破壞并吸除耳石器和壺腹嵴，最后填充浸有氯仿的明膠海綿，縫合切口。術(shù)后大鼠出現(xiàn)自發(fā)性眼震、頭偏斜、失衡行為等急性前庭功能喪失癥狀。之后眼震頻率逐漸下降，頭偏斜和失衡行為評分的變化與其均一致，進一步說明模型建造成功，動物出現(xiàn)了前庭代償。此建模方法可靠、經(jīng)濟，且技術(shù)成熟，缺點在于對動物有損傷，且氯仿具有耳毒性。

3.3 UL+乙醇化學(xué)破壞

1997年Tadashi Kitahara等[35]采用UL+乙醇化學(xué)破壞，建立了大鼠前庭代償模型，方法：大鼠麻醉后做右耳后切口，取出鼓膜、錘骨和砧骨，移除鐙骨足板、打開卵圓窗，在水平半規(guī)管上鉆一個開口，通過這兩個開口，手術(shù)切除膜迷路，注射乙醇，最后縫合切口。組織學(xué)研究表明迷路完全受損，并未損傷鄰近腦組織[35]，且運用此模型Tadashi Kitahara研究證實了上調(diào)小腦小葉單極刷細胞中一氧化氮的量可促進前庭代償。2013年Wen Zhou等[36]采用同樣的方法，建立大鼠前庭代償模型，并證實術(shù)后第1天，同側(cè)前庭內(nèi)側(cè)核mGluR7下調(diào)、小葉mGluR2上調(diào)，認(rèn)為mGluR2和mGluR7可能有助于前庭損傷后前庭內(nèi)側(cè)核自發(fā)靜息電位的早期再平衡。2016年Andreas Zwergal等[23]采用左旁正中切口通過UL+乙醇破壞迷路，建立大鼠前庭代償模型，通過此模型證實了迷路破壞后傳入神經(jīng)阻滯誘導(dǎo)的可塑性，主要表現(xiàn)在腦干前庭核的早期再平衡，也涉及丘腦-皮質(zhì)和邊緣區(qū)。此方法造模的優(yōu)點在于方法成熟，已有研究證實迷路完全破壞，造模成功率高，缺點在于受術(shù)者解剖知識及熟練程度的影響較大，且代償時間短，不便于研究臨床上需要數(shù)月才能恢復(fù)的前庭損傷后代償機制。

3.4 UL+慶大霉素化學(xué)破壞

2017年P(guān)atrick P.Hübner等[37]采用UL+慶大霉素化學(xué)破壞，建立小鼠前庭代償模型，具體方法：小鼠麻醉后做左耳前切口，去除鼓膜、錘骨和砧骨，擴大鼓室骨環(huán)，灼燒去除鐙骨動脈，將內(nèi)、外淋巴液吸出前庭，去除外半規(guī)管和前半規(guī)管的感覺上皮細胞，最后用浸有慶大霉素的明膠海綿填塞前庭，縫合皮膚。通過此模型研究證實了表達在前庭的α9煙堿型乙酰膽堿受體功能喪失，可影響動物術(shù)后的前庭-眼反射補償。此模型同UL+氯仿，慶大霉素也具有耳毒性。

4 其它

4.1 空氣注射法

2010年R.HESKIN-SWEEZIE等[38]采用空氣注射法造成小鼠前庭損傷，具體方法：小鼠麻醉后做右耳后切口，在水平半規(guī)管鉆孔，鈍針插入孔口，反復(fù)注射空氣，直到不再排出內(nèi)淋巴液，最后骨蠟密封，縫合切口。并證明γ-氨基丁酸B型受體有助于單側(cè)外周損毀后靜態(tài)前庭反射的補償，對動態(tài)補償沒有持久的影響。通過空氣注射法誘導(dǎo)小鼠前庭代償造模成功率達95%[38]，造模時間短，但會導(dǎo)致感覺上皮受損，且關(guān)于此法誘導(dǎo)的前庭代償文獻報道較少。

表1 前庭代償動物模型Table 1 Vestibular compensation animal model

5 結(jié)語

前庭代償是外周前庭受損后研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性、腦受損后探究機能修復(fù)的理想模型，且弄清前庭代償機制對提高前庭疾病的治療效果意義重大。因此，建立可靠的前庭代償動物模型十分必要。文中系統(tǒng)闡述基于不同的動物（大鼠、豚鼠、貓、小鼠、狒狒、青蛙）、不同的方法（手術(shù)切除、化學(xué)性迷路破壞、手術(shù)+化學(xué)方法破壞迷路、空氣注射）建立的前庭代償動物模型（見表1）。手術(shù)切除法運用時間長，建模方法成熟，可靠性高，但具有侵入性，可能會導(dǎo)致腦損傷，且受術(shù)者手術(shù)技術(shù)的影響?；瘜W(xué)方法破壞迷路是一種快速、方便且能產(chǎn)生可靠結(jié)果的方法，氯仿作為一種有機溶劑，有比較強的細胞毒作用，很早就被用來注射入中耳誘發(fā)急性迷路切除綜合征，但隨著時間的推移可能會產(chǎn)生前庭損傷。空氣注射法是一種更加經(jīng)濟的新型造模方法，同樣也能誘發(fā)前庭損傷后的癥狀，但文獻報道較少。手術(shù)+化學(xué)方法破壞迷路在上述造模手段的基礎(chǔ)上進一步改進，造模成功率較高，能更有效的、更完整的破壞迷路，其研究結(jié)果也表明這種方法是可靠的。

而目前運用較多的造模方法有UVN、對阿散酸及阿散酸鈉注射法和UL/UVD+乙醇化學(xué)破壞法。UVN因其完全的、不可逆的單側(cè)前庭損傷而成為可靠的前庭代償動物造模方法，單純的UL和UVD因存在手術(shù)迷路破壞不完整的可能性現(xiàn)已較少使用；對阿散酸及阿散酸鈉注射法因其操作簡單、結(jié)果可靠也運用于前庭代償動物造模，而氯仿因具有細胞毒作用且隨時間致前庭損害，現(xiàn)已較少使用；UL/UVD+乙醇化學(xué)破壞法因其能更完整、更有效的損壞迷路而在前庭代償動物實驗研究的造模中廣泛運用。本課題組前期研究，運用手術(shù)切除+乙醇化學(xué)破壞成功建立了豚鼠前庭代償模型，并驗證了豚鼠前庭內(nèi)側(cè)核存在毒蕈堿受體M2、M3亞型，推測其可能對早期前庭代償正常進行有促進作用[39]。但手術(shù)+化學(xué)方法破壞迷路仍存在一些缺陷和風(fēng)險，如：術(shù)前麻醉致死、術(shù)中損傷鐙骨動脈動物出血死亡、手術(shù)內(nèi)耳受損致動物耳聾、術(shù)后感染等。通過上述前庭代償動物模型，已有一些研究成果產(chǎn)生并應(yīng)用于臨床（如倍他司?。?，但還遠遠不夠，且目前這些動物模型仍有一些不足，還未有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)模型產(chǎn)生。因此深入研究前庭代償機制和中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性，建立相似性高、重復(fù)性好的前庭代償動物模型，采用更加規(guī)范、實用、客觀的急性前庭綜合征評價方法和指標(biāo)，是今后進一步努力和完善的方向。