診斷性介入肺臟病學(xué)取材聯(lián)合病原微生物宏基因組測(cè)序在肺部感染應(yīng)用的原則

吳波，馮靖，張靜，王家卉

肺部感染是全世界人口主要死亡原因之一［1］。然而，由于數(shù)百種病原體與肺部感染有關(guān)，包括細(xì)菌［2］、病毒［3］和真菌［4］，其診斷具有挑戰(zhàn)性。肺部感染的快速微生物學(xué)診斷有助于及時(shí)進(jìn)行抗微生物病原體治療。 介入肺臟病學(xué)（interventional pulmonology，IP）作為一種依靠先進(jìn)、安全的診斷和治療程序來管理良、惡性肺病的醫(yī)學(xué)專業(yè)，在肺部感染診斷方面發(fā)揮重要作用［5］。傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)技術(shù)如涂片和培養(yǎng)都相對(duì)不敏感，且檢驗(yàn)過程耗時(shí)較長(zhǎng)；組織病理學(xué)是診斷侵襲性真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，然而它需要時(shí)間［6］。測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展使病原微生物宏基因組測(cè)序技術(shù)（microbial metagenomics sequencing，mMS）不斷成熟，mMS僅需從樣品中直接獲取少量遺傳物質(zhì)并進(jìn)行測(cè)序，通過將測(cè)序讀數(shù)與準(zhǔn)確的參考基因組數(shù)據(jù)庫聯(lián)系起來即可鑒定病原體。診斷性介入肺臟病學(xué)（diagnostic interventional pulmonology，dIP）+mMS 技術(shù)有利于肺部感染病原微生物的診斷，提高診斷速度及敏感性。dIP+mMS應(yīng)與傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用且相互補(bǔ)足，而非替代傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)技術(shù)；同時(shí)應(yīng)緊密結(jié)合臨床信息解讀mMS報(bào)告。

1 dIP+mMS的適用范圍

入院之初或疾病治療當(dāng)中，如臨床及影像學(xué)提示可能為特殊的、不常見的病原，非一般社區(qū)獲得性感染，非常見院內(nèi)獲得性感染，即應(yīng)進(jìn)行dIP+mMS，不必等到臨床長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)治療效果不佳時(shí)；初步經(jīng)驗(yàn)性治療反應(yīng)不佳，且傳統(tǒng)病原微生物檢測(cè)陰性，針對(duì)性治療難以進(jìn)行；免疫缺陷患者，出現(xiàn)呼吸道癥狀或影像學(xué)變化，提示肺部感染時(shí)，經(jīng)驗(yàn)性治療同時(shí)即應(yīng)盡快安排dIP+mMS；感染造成的呼吸危重癥患者，應(yīng)盡快安排dIP+mMS；影像學(xué)提示肺部病灶，但需啟動(dòng)可能造成較重免疫缺陷的治療，需除外感染時(shí)；流行病學(xué)調(diào)查等，需非常明確的病原分型，需精確至種，甚至要求明確病原基因型時(shí)；其他需明確病原或除外感染的情況。

2 dIP+mMS的常用取材方式

2.1 經(jīng)支氣管肺活檢（transbronchial lung biopsy，TBLB） 影像學(xué)提示病灶較明確，TBLB可取得代表性病灶的，經(jīng)快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)（rapid on site evaluation，ROSE）確認(rèn)，TBLB 組織粒送檢dIP+mMS；若考慮存在非感染性病灶可能，TBLB 可取得代表性病灶的，經(jīng)ROSE確認(rèn)，TBLB組織粒送檢dIP+mMS并組織病理學(xué)檢查以排除感染；單靶部位單次送檢不少于2粒組織粒。

2.2 經(jīng)支氣管刷檢（transbronchial brushing，TBBr） 影像學(xué)提示病灶較明確，馮氏二級(jí)防污染毛刷和封堵超細(xì)針?biāo)BBr 可刷經(jīng)代表性病灶的，TBBr 刷頭送檢dIP+mMS；TBBr 不可刷經(jīng)代表性病灶，但可刷經(jīng)代表性病灶上級(jí)引流氣道的，TBBr 刷頭也可送檢dIP+mMS，但效果較之可直接刷經(jīng)代表性病灶的差；單靶部位單次送檢不少于1枚刷頭。

2.3 支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage，BAL） 影像學(xué)提示病灶較明確，BAL可灌及代表性病灶的，支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）送檢dIP+mMS；BAL 不可灌及代表性病灶，但可灌及代表性病灶上級(jí)引流氣道的，BALF 也可送檢dIP+mMS，但效果較之可直接灌及的差；單靶部位單次送檢BALF不少于3 mL。

3 dIP+mMS常用不同取材方式的合理選擇

TBLB所取組織粒代表肺部1個(gè)或數(shù)個(gè)取材點(diǎn)，如獲得代表性病灶，其內(nèi)含高濃度病原，敏感度、特異度均較好。因鉗杯內(nèi)相對(duì)隔離，屬于保護(hù)性取材，如獲得代表性病灶，易于區(qū)分感染或是定植。對(duì)于ROSE 可見病原與非感染性病灶可較好地借助ROSE 優(yōu)勢(shì)。對(duì)于非感染性病灶可較好地借助組織病理學(xué)優(yōu)勢(shì)。對(duì)組織深在病原感染，如耶氏肺孢子菌感染后期、巨細(xì)胞病毒感染等，易于區(qū)分感染或是定植。涉及范圍僅為1 個(gè)或數(shù)個(gè)取材點(diǎn)，如不能獲得代表性病灶，可致假陰性。出現(xiàn)操作相關(guān)并發(fā)癥如出血、氣胸等的可能性高于TBBr和BAL。對(duì)術(shù)者與助手操作技術(shù)與經(jīng)驗(yàn)的要求遠(yuǎn)高于TBBr與BAL。

TBBr 所取刷頭代表肺部1 條或數(shù)條取材線，如刷經(jīng)代表性病灶，其內(nèi)含較高濃度病原，敏感度、特異度均好于BAL但遜于TBLB；采用馮氏二級(jí)防污染毛刷與針?biāo)⑺⒔?jīng)代表性病灶，屬于保護(hù)性取材，易于區(qū)分感染或是定植；可一定程度上借助ROSE優(yōu)勢(shì)，尤其是對(duì)于ROSE 可見病原與非感染性病灶，但無論制片與判讀效果均明顯遜于TBLB；不能借助組織病理學(xué)優(yōu)勢(shì)，尤其是對(duì)于非感染性病灶；對(duì)組織深在病原感染，如耶氏肺孢子菌感染后期、巨細(xì)胞病毒感染等，敏感度、特異度均好于BAL但遜于TBLB；涉及范圍為1 條或數(shù)條取材線，明顯廣于TBLB 但少于BAL，如不能刷經(jīng)代表性病灶或代表性病灶上級(jí)引流氣道，可致假陰性；出現(xiàn)操作相關(guān)并發(fā)癥如出血、氣胸等的可能性明顯低于TBLB，但高于BAL；對(duì)術(shù)者與助手操作技術(shù)與經(jīng)驗(yàn)的要求遠(yuǎn)低于TBLB，但高于BAL。

BALF代表肺部1個(gè)或數(shù)個(gè)取材扇或取材團(tuán)，如灌及代表性病灶，其內(nèi)可含一定濃度病原，但敏感度、特異度均遜于TBLB和TBBr；含口腔與主氣道雜菌較多，污染較重，極易混淆，不易區(qū)分感染或是定植；不能借助ROSE 優(yōu)勢(shì)，尤其是對(duì)于ROSE 可見病原與非感染性病灶；不能借助組織病理學(xué)優(yōu)勢(shì)，尤其是對(duì)于非感染性病灶；對(duì)組織深在病原感染，如耶氏肺孢子菌感染后期、巨細(xì)胞病毒感染等，敏感度、特異度均遜于TBLB 和TBBr，但對(duì)于氣道和肺泡表面病原，如活動(dòng)性肺結(jié)核、耶氏肺孢子菌感染早期，部分巨細(xì)胞病毒感染，則具較好的敏感度與特異度；涉及范圍為1 個(gè)或數(shù)個(gè)取材扇或取材團(tuán)，明顯廣于TBLB 與TBBr，容易包括代表性病灶或代表性病灶上級(jí)引流氣道，不易遺漏病灶位置；出現(xiàn)操作相關(guān)并發(fā)癥如出血、氣胸等的可能性較低；易于操作，對(duì)術(shù)者與助手操作技術(shù)與經(jīng)驗(yàn)的要求較低。

綜上，應(yīng)綜合臨床資料、影像學(xué)、術(shù)者與助手操作技術(shù)與經(jīng)驗(yàn)、現(xiàn)有導(dǎo)航技術(shù)裝備及耗材、衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)等多種因素選擇其中1種或聯(lián)用多種取材方式送檢dIP+mMS。

4 dIP+mMS常用不同取材方式的封裝

TBLB：用無菌注射器針頭將組織粒從鉗杯中挑出，直接置于2 mL 無菌微量離心管內(nèi)，使其貼附側(cè)壁，扣嚴(yán)封蓋。TBBr：用無菌剪刀將刷頭剪入（過程中應(yīng)嚴(yán)防浸泡剪刀的乙醇或消毒液沾染刷頭，因該沾染可滅活部分微生物病原形成假陰性）預(yù)裝1 mL無菌生理鹽水的2 mL 無菌微量離心管內(nèi)，扣嚴(yán)封蓋。BALF：將不少于5 mL BALF 置于無菌收集器內(nèi)，扣嚴(yán)封蓋。-20 ℃冰箱內(nèi)短期存放，備用。

5 dIP+mMS 支氣管鏡的選擇、引導(dǎo)內(nèi)鏡技術(shù)及ROSE的輔助使用

對(duì)于外周（1/3）肺部感染性病灶的取材，推薦使用細(xì)支氣管鏡或超細(xì)支氣管鏡，以求盡量深入接近病灶。對(duì)于不可直接視及肺部感染性病灶的取材，推薦使用引導(dǎo)內(nèi)鏡技術(shù)，包括手繪導(dǎo)航、虛擬導(dǎo)航、電磁導(dǎo)航、透視等，以求盡量取得代表性病灶本身。作為一種細(xì)胞學(xué)載體，ROSE 具備相應(yīng)功能，包括評(píng)價(jià)取材滿意度，實(shí)時(shí)指導(dǎo)介入操作手段與方式，形成初步診斷或縮窄鑒別診斷范圍，優(yōu)化靶部位標(biāo)本進(jìn)一步處理方案，結(jié)合全部臨床信息與細(xì)胞學(xué)背景進(jìn)行病情分析與轉(zhuǎn)歸預(yù)判［7］。這些功能在TBLB 和TBBr 的dIP+mMS 中極其重要，可提高其敏感度、特異度，降低假陰性率。TBLB 和TBBr dIP+mMS 中ROSE 所需耗材，如針頭、玻片等，需預(yù)先經(jīng)清潔、消毒、滅菌。

6 不同取材方式所獲標(biāo)本遺傳物質(zhì)的測(cè)序方式

對(duì)于不同取材方式所獲標(biāo)本分別提取遺傳物質(zhì)，合并上機(jī)測(cè)序（雞尾酒方式），有利于降低成本，但同時(shí)也降低了dIP+mMS的敏感性。由于BALF含口腔與主氣道雜菌較多，污染較重，微生物負(fù)荷較高，可明顯拉低其他取材方式所獲標(biāo)本dIP+mMS敏感度，故BALF 應(yīng)獨(dú)立檢測(cè)；雞尾酒方式的推薦方案可為：多靶部位TBLB組織粒的混合、多靶部位TBBr刷頭的混合、多靶部位TBLB 組織粒和TBBr 刷頭的混合以及多靶部位BALF的混合。

7 抗菌藥物對(duì)dIP+mMS的影響

全身和局部抗菌藥物的應(yīng)用可顯著影響dIP+mMS 的檢出，形成假陰性；特別需注意抗結(jié)核藥物或喹諾酮類抗生素的應(yīng)用可影響dIP+mMS 對(duì)于結(jié)核分支桿菌的檢出。

8 dIP+mMS取材部位的選擇

建議于實(shí)變而非壞死部位、新發(fā)病灶、有變化病灶或病灶與正常組織交界部位取材進(jìn)行dIP+mMS，不建議于壞死、陳舊病灶、長(zhǎng)期無變化病灶或纖維瘢痕、鈣化部位取材進(jìn)行dIP+mMS。

dIP+mMS在微生物學(xué)診斷中發(fā)揮著日益重要的作用［8-9］。通過使用細(xì)支氣管鏡或超細(xì)支氣管鏡，結(jié)合引導(dǎo)內(nèi)鏡技術(shù)，應(yīng)用dIP 在合適部位進(jìn)行取材，ROSE 實(shí)時(shí)指導(dǎo)介入操作，從所獲標(biāo)本提取遺傳物質(zhì)，上機(jī)測(cè)序，并緊密結(jié)合臨床信息解讀mMS報(bào)告，可以為肺部感染患者提供快速精準(zhǔn)的病原學(xué)診斷依據(jù)，及時(shí)進(jìn)行抗感染治療。