CREB在血管新生、抗凋亡以及肺癌中的研究進(jìn)展

劉肖，段勇，張艷亮

cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein,CREB）是一種含有341 個(gè)氨基酸殘基的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，分子質(zhì)量為43 ku，屬于轉(zhuǎn)錄因子bZIP 家族。cAMP 反應(yīng)元件（cAMPresponse element，CRE）是一段由30 bp 左右的DNA片段構(gòu)成的cAMP 應(yīng)答序列，此序列含有高度保守的8 堿基回文結(jié)構(gòu)（5′-TGACGTCA-3′），可存在于基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子上。CREB的C-末端具有富含大量堿性氨基酸的亮氨酸拉鏈基序，該基序可形成二聚體結(jié)合至CRE 來(lái)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，故CREB 又被稱作轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子。蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）被cAMP 激活后進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而磷酸化CREB中含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的N-末端激酶誘導(dǎo)域（KID），其中第133位的絲氨酸殘基（Ser133）作為KID區(qū)重要的磷酸化位點(diǎn)之一，對(duì)CREB 的轉(zhuǎn)錄活性起著重要的調(diào)控作用?；罨腃REB參與多種信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及能量代謝，與多種腫瘤的生長(zhǎng)及血管形成有關(guān)［1-2］。本文就CREB基因的生物學(xué)功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用做一綜述。

1 上游信號(hào)通路對(duì)CREB的調(diào)節(jié)

1.1 cAMP/PKA 通路對(duì)CREB 的調(diào)節(jié) 細(xì)胞外信號(hào)分子與細(xì)胞膜相關(guān)G 蛋白偶聯(lián)受體（G-proteincoupled recptors，GPCR）結(jié)合后可激活腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC），AC 促進(jìn)cAMP 生成進(jìn)而激活PKA，活化的PKA 進(jìn)入細(xì)胞核催化CREB 的Ser133磷酸化，從而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。AC抑制劑可通過(guò)抑制cAMP 生成，下調(diào)磷酸化CREB（phosphorylated CREB，p-CREB）的表達(dá)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)［3］。

1.2 Ca2+/CaM/CaMKⅡ通路對(duì)CREB 的調(diào)節(jié) 存在于細(xì)胞膜上的磷脂酶C 被GPCR 激活后，可促進(jìn)甘油二酯的產(chǎn)生并激活蛋白激酶C，進(jìn)而使L型電壓門控Ca2+通道磷酸化，Ca2+通道的開(kāi)放可引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+水平上調(diào)，大量的Ca2+與鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM）結(jié)合后可活化鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ/Ⅳ（Calmodulin kinases Ⅱ/Ⅳ，CaMK Ⅱ/Ⅳ），導(dǎo)致CREB 磷酸化從而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)高鹽溶液可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+減少，進(jìn)而使CaMKⅡ失活并導(dǎo)致CREB中的Ser133去磷酸化［4］。

1.3 MAPK 通路對(duì)CREB 的調(diào)節(jié) MAPK 信號(hào)通路在CREB 的調(diào)節(jié)中起著十分重要的作用，其所包含的ERK1/2 等通路對(duì)CREB 的調(diào)節(jié)機(jī)制已被廣泛研究［5-6］。在慢性應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁過(guò)程中，ERK/CREB信號(hào)通路發(fā)生抑制會(huì)導(dǎo)致CREB 的磷酸化水平下調(diào)，不同的抗抑郁治療方式都可通過(guò)上調(diào)ERK 和CREB 水平從而達(dá)到理想的治療效果［5］。多種細(xì)胞在接受外界刺激后可產(chǎn)生磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)（Ras/Raf/MEK/ERK）進(jìn)而激活ERK1/2，活化的ERK1/2 將信號(hào)放大并傳入細(xì)胞核使CREB磷酸化，p-CREB通過(guò)與DNA的特定部位結(jié)合參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。有研究報(bào)道，MAPK/ERK/CREB 信號(hào)傳導(dǎo)途徑還與腦缺血再灌注損傷的發(fā)生密切相關(guān)［6］。

1.4 PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)CREB的調(diào)節(jié) 表皮生長(zhǎng)因子受體/PI3K/Akt 通路可阻止腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)程序性死亡程序，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Lim等［7］研究證明，細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt 和MAPK/MSK 途徑的聯(lián)合作用能夠增強(qiáng)CREB 的磷酸化水平。在乳腺腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt 信號(hào)通路可激活新型雌激素/G 蛋白偶聯(lián)雌激素受體/cAMP/PKA/CREB 信號(hào)軸，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)常規(guī)臨床藥物多重耐藥［8］。

2 CREB在血管生成中的作用

血管為細(xì)胞帶來(lái)氧氣并運(yùn)走代謝廢物，在細(xì)胞的新陳代謝中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在腫瘤中，由于腫瘤細(xì)胞快速增殖導(dǎo)致其與間質(zhì)血管的距離不斷增加，造成了腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境的形成，不利于腫瘤生長(zhǎng)，這時(shí)腫瘤細(xì)胞可以釋放多種血管生成因子和蛋白酶，導(dǎo)致機(jī)體正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生數(shù)量和形態(tài)學(xué)改變，正常毛細(xì)血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解，血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖最終導(dǎo)致腫瘤微血管分化和成型，以供應(yīng)腫瘤自身生長(zhǎng)所需。一種前列腺素選擇性競(jìng)爭(zhēng)受體EP4 的拮抗劑GW627368X 可通過(guò)減少PKA 磷酸化進(jìn)而導(dǎo)致CREB 活化減少，從而控制與腫瘤細(xì)胞存活、增殖和血管生成相關(guān)的關(guān)鍵基因（EP4、VEGF等）的異常轉(zhuǎn)錄［9］。慢性應(yīng)激反應(yīng)通過(guò)激活交感-腎上腺髓質(zhì)軸來(lái)調(diào)控兒茶酚胺的釋放，被兒茶酚胺激活的CREB在小鼠異位子宮內(nèi)膜和前列腺癌中誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和血管生成，β-腎上腺素能受體阻斷劑可通過(guò)抑制CREB 活化進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，從而完全消除這種慢性應(yīng)激反應(yīng)［10-11］。香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）可激活肺內(nèi)皮細(xì)胞系中的PKA/CREB/IL-13Rα2軸，該信號(hào)軸可促進(jìn)肺內(nèi)皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，也可促進(jìn)具有強(qiáng)大血管生成及致癌能力的腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的大量產(chǎn)生［1］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，作為ATF/CREB家族一員的轉(zhuǎn)錄激活因子4（Activating transcription factor 4，ATF4）在乳腺癌中過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向腫瘤組織募集，進(jìn)而間接促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［12］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C（VEGFC）可誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成，這些反應(yīng)需要CREB 介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路的激活［13］。以上研究結(jié)果均表明CREB基因在腫瘤血管生成中發(fā)揮著重要的作用，可作為新型抗腫瘤血管生成藥物研發(fā)的候選靶點(diǎn)。

3 CREB在細(xì)胞增殖及抗凋亡中的作用

細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡。某些細(xì)胞由于遺傳物質(zhì)變異使得正常的凋亡程序遭到破壞，異常細(xì)胞增殖不斷加速并獲得凋亡抗性，CREB 參與細(xì)胞的異常增殖和抗凋亡過(guò)程。細(xì)胞有氧代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一系列的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），過(guò)高水平的ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞和基因結(jié)構(gòu)造成損壞，CREB 可通過(guò)作用于H2O2酶來(lái)減輕ROS 對(duì)細(xì)胞的毒性損傷作用，從而保持氧化應(yīng)激環(huán)境下的線粒體活性以促進(jìn)細(xì)胞存活，CREB 沉默則可導(dǎo)致氧化應(yīng)激后細(xì)胞凋亡的增加［14］。Pregi 等［15］發(fā)現(xiàn)H2O2處理后的CREB 可促進(jìn)DNA 修復(fù)，他們使用cDNA 微陣列分析表明，CREB 能夠?qū)⑴c氧化后損傷的DNA 修復(fù)以及與細(xì)胞存活有關(guān)的多種基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，以介導(dǎo)細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡模式形成。先前有研究證實(shí)微小核糖核酸-433（MicroRNA-433，miR-433）在人類腫瘤中發(fā)揮廣泛功能［16］，現(xiàn)有研究表明，miR-433-3p 過(guò)表達(dá)會(huì)抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Sun等［17］利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)并結(jié)合螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)和蛋白質(zhì)印跡分析證明了CREB 是miR-433-3p 的 直 接 作 用 靶 標(biāo)。1，2-二 氯 乙 烷（1，2-Dichloroethane，1，2-DCE）是一種氯化有機(jī)毒物，其可以抑制CREB 信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)與線粒體功能障礙相關(guān)的細(xì)胞凋亡過(guò)程［18］。阿霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡與PKA/CREB信號(hào)通路上調(diào)線粒體呼吸鏈復(fù)合物的水平也存在相關(guān)性［19］。有研究人員通過(guò)磷酸化動(dòng)力學(xué)和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)分析表明，髓細(xì)胞白血病因子-1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）的表達(dá)受CREB調(diào)節(jié)，CREB沉默將導(dǎo)致抗凋亡蛋白MCL-1的表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡水平上升［20］。

4 CREB在尼古丁致癌過(guò)程中的作用

吸煙是眾多癌癥的誘發(fā)因素，已有大量研究表明煙草化合物中的尼古丁通過(guò)CREB途徑在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1,21-23］。CSEs 可通過(guò)激活PKA/CREB 信號(hào)通路使致瘤性白細(xì)胞介素-13受體α2 基因（IL-13Rα2）過(guò)表達(dá)，IL-13Rα2 的過(guò)表達(dá)顯著增加了細(xì)胞的致瘤性、遷移性和血管生成能力［1］。由煙堿乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）介導(dǎo)的與尼古丁相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑涉及到非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，Al-Wadei等［21-22］通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到，尼古丁處理后的NSCLC 裸鼠血清、血細(xì)胞和移植瘤組織中的nAChR 和cAMP 水平與對(duì)照組相比均有所上升，尼古丁通過(guò)上調(diào)nAChR和cAMP信號(hào)分子來(lái)激活致癌途徑中的關(guān)鍵蛋白（CREB、ERK、Akt 等），從而介導(dǎo)癌癥的發(fā)生，同樣有實(shí)驗(yàn)觀察到在尼古丁處理后的NSCLC 細(xì)胞中，nAChR 以及p-CREB 的表達(dá)水平隨著去甲腎上腺素分泌量的增加而增加，進(jìn)而導(dǎo)致DNA合成和細(xì)胞增殖增加。尼古丁可增強(qiáng)CREB磷酸化，p-CREB 與攜帶G 等位基因的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-7基因啟動(dòng)子特異性結(jié)合后可增強(qiáng)MMP-7 的表達(dá)水平，MMP-7 在惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等一系列腫瘤生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用［23］。Fisher等［24］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，CREB在大腦海馬背側(cè)和腹側(cè)介導(dǎo)的尼古丁成癮戒斷過(guò)程中分別扮演著不同的角色，CREB 可通過(guò)改變其轉(zhuǎn)錄情況來(lái)介導(dǎo)尼古丁戒斷過(guò)程中的焦慮和認(rèn)知障礙，探索藥物與CREB 基因作用的復(fù)雜機(jī)制將為戒煙藥物的研發(fā)提供更多的幫助。

5 CREB與肺癌

6例NSCLC患者的肺癌組織與相鄰正常組織的蛋白印跡結(jié)果顯示，肺癌組織中的原癌基因CT45A1和CREB 的表達(dá)量顯著上調(diào)，CT45A1基因被干擾后可通過(guò)抑制ERK/CREB信號(hào)通路來(lái)抑制癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，表明CREB 與肺癌的發(fā)生存在著密切聯(lián)系［25-26］。Xia 等［27］利用慢病毒載體構(gòu)建了小細(xì)胞肺癌（SCLC）小鼠模型，并假設(shè)阻斷CREB 通路有助于抑制SCLC的發(fā)生，他們通過(guò)在同系移植模型中檢測(cè)載有3-shRNA 載體的SCLC 細(xì)胞系在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)狀況來(lái)驗(yàn)證該想法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)通過(guò)抑制PKA/CREB 途徑可顯著抑制SCLC 的發(fā)展，表明CREB 信號(hào)通路的抑制確實(shí)有助于降低SCLC 的發(fā)生。糖原合成酶激酶（GSK）-3 是一種與細(xì)胞周期、分化和凋亡有關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其同工酶之一的GSK-3α 受CREB 的調(diào)節(jié)，GSK-3α 和CREB 的表達(dá)水平均與肺癌患者的生存期呈負(fù)相關(guān)，敲減GSK-3α?xí)档湍[瘤細(xì)胞活力和腫瘤生長(zhǎng)速度，這些發(fā)現(xiàn)提示GSK-3α 是CREB 的關(guān)鍵靶基因，CREB/GSK-3α 信號(hào)傳導(dǎo)通路可成為肺癌治療的潛在靶點(diǎn)［28］。AKT/CREB 和AKT/WNK 信號(hào)通路在肺癌細(xì)胞中可通過(guò)促進(jìn)色氨酸代謝物犬尿氨酸（Kynurenine，Kyn）的生成，來(lái)抑制樹突狀細(xì)胞的分化并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移［29］。以上研究結(jié)果均表明，CREB 與肺癌的發(fā)生發(fā)展存在著密切的相關(guān)性，提示CREB及其家族基因可成為未來(lái)肺癌研究領(lǐng)域的重要切入點(diǎn)。

6 與CREB有關(guān)的癌癥治療

分子靶向治療是指在細(xì)胞分子水平上，針對(duì)已經(jīng)明確的致癌位點(diǎn)（該位點(diǎn)可以是腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)基因片段，也可以是一個(gè)蛋白分子）設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)會(huì)特異地結(jié)合于致癌位點(diǎn)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生特異性死亡。CREB 在血管新生、細(xì)胞增殖與抗凋亡以及尼古丁致癌途徑中均扮演著重要的角色，因此靶向CREB 及其信號(hào)通路關(guān)鍵分子的治療方式在癌癥領(lǐng)域具有十分廣闊的研究前景。姜黃素通過(guò)激活P-CREB/BDNF 通路來(lái)減少尼古丁誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等不良反應(yīng)，可能是一種減輕由尼古丁引起的細(xì)胞毒性的潛在治療劑［30］。脂連蛋白可通過(guò)劑量和時(shí)間依賴性的方式逐漸抑制CREB 磷酸化并改變細(xì)胞周期，具有潛在的抗癌作用［25］。長(zhǎng)鏈還原型輔酶Ⅱ氧化酶5（NOX5-L）的適量表達(dá)可導(dǎo)致AKT 和ERK 磷酸化從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖，而過(guò)量的NOX5-L則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，順鉑可通過(guò)活化CREB 來(lái)增加NOX5-L 的表達(dá)水平，并通過(guò)增強(qiáng)Ca2+等的釋放增強(qiáng)NOX5-L 的活性，高濃度的NOX5-L最終可觸發(fā)ROS誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡［31］。Yu 等［32］指出β-連環(huán)蛋白可通過(guò)與CREB 結(jié)合蛋白的聯(lián)合作用促進(jìn)肺癌發(fā)生，表明聯(lián)合靶向β-連環(huán)蛋白和CREB結(jié)合蛋白可能是治療肺癌的有效策略。AKT 激酶互作蛋白1（Akt kinase interacting protein 1，AKI1）/CREB 軸在彌漫性惡性間皮瘤中發(fā)揮著重要作用，AKI1沉默會(huì)降低腫瘤細(xì)胞的活力并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，因此靶向AKI1/CREB 軸可成為胸腔內(nèi)局部腫瘤治療的新思路［33］。髓源性抑制細(xì)胞（myeloid suppressor cells，MDSC）會(huì)影響腫瘤的有效免 疫 治 療，Tian 等［34］確 定CREB 參 與 調(diào) 節(jié)microRNA-9（miR-9）在MDSC中的表達(dá)，通過(guò)CREB降低miR-9的表達(dá)可減少M(fèi)DSC介導(dǎo)的腫瘤免疫抑制。針對(duì)CREB信號(hào)通路的靶向治療可選擇性地殺滅腫瘤細(xì)胞，明顯改善治療效果，是一種延長(zhǎng)腫瘤患者生存期的有效治療方式。

7 展望

腫瘤血管的大量生成為腫瘤生長(zhǎng)提供了充足的營(yíng)養(yǎng)，增強(qiáng)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的同時(shí)也提高了腫瘤的惡性程度，是腫瘤生長(zhǎng)、演進(jìn)過(guò)程中的關(guān)鍵，研究已證實(shí)CREB 是參與多種腫瘤血管生成的重要蛋白。抑制CREB及其信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)可以減少腫瘤血管生成，切斷腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需氧氣及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，這將是一種全新的腫瘤靶向治療策略。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞凋亡在腫瘤治療中的重要性逐漸被發(fā)掘，CREB通過(guò)修復(fù)氧化應(yīng)激后損傷的DNA，以及通過(guò)解除氧化應(yīng)激副產(chǎn)物ROS的毒性等抗凋亡方式促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活與增殖，為求最大限度地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞特異性凋亡，CREB 及其信號(hào)通路必將成為未來(lái)腫瘤促凋亡治療的有效切入點(diǎn)。香煙煙霧提取物中的尼古丁成分與多種腫瘤（尤其是肺癌）的發(fā)生發(fā)展存在密切相關(guān)性，CREB 及其信號(hào)通路也被發(fā)現(xiàn)在尼古丁致癌過(guò)程中發(fā)揮重要作用，除尼古丁以外還有多種因素同樣可通過(guò)CREB信號(hào)通路介導(dǎo)癌癥的發(fā)生。綜上所述，抑制CREB 及其信號(hào)通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子靶向治療技術(shù)有望成為腫瘤研究領(lǐng)域的重點(diǎn)，CREB 基因家族在未來(lái)多種腫瘤（尤其是肺癌）的形成及治療領(lǐng)域擁有十分廣闊的研究前景。