外泌體與膽道閉鎖肝纖維化研究進(jìn)展

趙金鳳，詹江華

膽道閉鎖（Biliary atresia，BA）是一種威脅嬰幼兒生命的纖維性炎癥性疾病。北美及西歐的發(fā)病率約為1/16 000，東南亞發(fā)病率較高，約為1/9 600～1/5 300［1］。BA以肝內(nèi)膽管大量增生，膽道的炎性和纖維化性閉塞為病理特點(diǎn)，即使早期行肝門-空腸吻合術(shù)也只能改善膽汁引流，自體肝生存狀況欠佳，大多數(shù)的患兒仍會(huì)發(fā)生進(jìn)行性肝纖維化,危及生命［2］。本文將從細(xì)胞因子、信號(hào)通路等方面分析外泌體與BA肝纖維化之間的關(guān)系，以期為臨床干預(yù)纖維化進(jìn)程，延長BA患兒自體肝生存時(shí)間提供新的方向。

1 BA肝纖維化

肝纖維化是門靜脈周圍區(qū)域或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)沉積過多，導(dǎo)致肝結(jié)構(gòu)扭曲、功能受損、可進(jìn)展為肝硬化，最終可危及生命。BA的肝纖維化機(jī)制更為復(fù)雜，而且BA患兒發(fā)生不可逆的肝臟纖維化是阻礙自體肝生存的關(guān)鍵。因此，許多學(xué)者不遺余力地對(duì)BA肝纖維化機(jī)制進(jìn)行探索，以期望發(fā)現(xiàn)有效遏制纖維化進(jìn)程的靶點(diǎn)。目前，研究發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控因子及信號(hào)通路在肝纖維化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。其中，纖維結(jié)締組織生長因子（vonnective tissue growth factor，CTGF/CCN2）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是典型的促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵因子，在膽道上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞上均有表達(dá)，而且兩者的早期表達(dá)均隨著肝纖維化程度的加深而愈加明顯［3］。此外，肝星狀細(xì)胞（HSCs）的活化被認(rèn)為是肝纖維化的核心，而CTGF 能通過調(diào)節(jié)HSCs的活化以促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生［4］。TGF-β1同樣作為纖維化發(fā)生過程中關(guān)鍵的細(xì)胞因子，既能促進(jìn)活化的HSCs遷移，又能介導(dǎo)HSCs轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致遷移至門管區(qū)的HSCs釋放大量基質(zhì)成分,加之轉(zhuǎn)分化而來的肌成纖維細(xì)胞也分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，最終使肝纖維化進(jìn)一步加重［5-6］。BA患兒肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生TGF-β2，當(dāng)膽管損傷，整合素蛋白avβ6 啟動(dòng)TGF-β1 信號(hào)通路，使之與磷酸化的Smad2/3形成絡(luò)合物，向細(xì)胞核移動(dòng)，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，分泌膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和纖維黏連蛋白，加重細(xì)胞外基質(zhì)沉積。信號(hào)通路下游分子基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）和人纖溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）過度表達(dá)，抑制了基質(zhì)成分降解，加速肝纖維化進(jìn)程［7］。

2 外泌體

外泌體是多泡體與質(zhì)膜融合后釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，并含有特殊的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA 以及microRNA（miRNA）的納米級(jí)囊泡，具有一定生理功能［8-9］。體外培養(yǎng)后形成具有胞外酶活性的細(xì)胞系脫落的微囊泡，電鏡下測量其直徑約為50～100 nm。直至1987年，Johnstone 等［9］將其觀察到的網(wǎng)織紅細(xì)胞分泌的微小囊泡定義為外泌體（exosome）。細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是細(xì)胞釋放的囊泡的統(tǒng)稱。外泌體是EVs中體積最小的囊泡［10］。其形成過程較為復(fù)雜，主要包含3 部分：（1）細(xì)胞外物質(zhì)或細(xì)胞膜蛋白由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞后形成胞內(nèi)早期內(nèi)體。（2）在細(xì)胞內(nèi)逐漸成熟，形成晚期內(nèi)體，在內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）的協(xié)調(diào)下以內(nèi)出芽方式組裝成腔內(nèi)囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），此時(shí)的晚期內(nèi)體稱為多泡體（multivesicular bodies，MVBs）。（3）一部分MVBs直接與溶酶體結(jié)合，被降解后排出；另一部分MVBs 與質(zhì)膜融合時(shí)ILVs 被釋放到細(xì)胞外，即外泌體。超速離心提取時(shí)其在1.13～1.19 g/mL蔗糖密度范圍富集。在體內(nèi)廣泛分布于包括血液、唾液、尿液、母乳、支氣管灌洗液、腦脊液、膽汁、羊水、惡性腹水等在內(nèi)的體液中，其在血清中濃度約3×106/μL［10-11］。

外泌體不僅在體內(nèi)分布廣泛，且依靠其自身特性具有一定的功能：（1）含有大量參與細(xì)胞信號(hào)通路的蛋白，如β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、WNT5B、Notch配體Delta-like 4（Dll4）。（2）功能性傳遞。體外實(shí)驗(yàn)證明外泌體同時(shí)包含mRNA和microRNA，可以被傳遞到另一個(gè)細(xì)胞，并在新的位置發(fā)生或影響轉(zhuǎn)錄和翻譯［12］。（3）細(xì)胞間通信。由某種分泌外泌體的細(xì)胞（近端元素）、包裹了信號(hào)分子的外泌體（信使）及接收和處理信息的遠(yuǎn)端細(xì)胞3部分構(gòu)成［13］。（4）免疫調(diào)節(jié)，B 淋巴細(xì)胞釋放含有主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅱ的外泌體，能引起T 細(xì)胞反應(yīng)。外泌體在腫瘤檢測及組織修復(fù)方面應(yīng)用前景廣泛［14-16］。

3 外泌體參與BA肝纖維化的調(diào)節(jié)

近年來，隨著對(duì)外泌體的研究升溫，其參與調(diào)節(jié)BA 肝纖維化的功能也逐漸被關(guān)注。外泌體主要是作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞的載體來調(diào)節(jié)肝纖維化進(jìn)程。已知CTGF/CCN2促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在BA肝纖維化患兒體內(nèi)，CCN2在肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞表達(dá)量也與肝纖維化程度呈正相關(guān)［3］。CCN2 的含量受轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Twist1、miRNA-214 影響。在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，Twist1 驅(qū)動(dòng)miRNA-214 與CCN2 的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）靶向結(jié)合，直接導(dǎo)致CCN2的mRNA 表達(dá)量下降［4］。一般情況下，靜止的HSCs分泌包含miRNA-214 的外泌體，并向臨近細(xì)胞傳遞，在靶細(xì)胞內(nèi)與CCN2 的3′-UTR 結(jié)合，所以，CCN2的含量保持在正常水平，不會(huì)過度升高［17］。當(dāng)肝臟組織受損誘發(fā)肝臟纖維化時(shí)，HSCs 發(fā)生活化，活化后的HSCs 可分泌包含CCN2 或CCN2 mRNA 的外泌體，通過質(zhì)膜融合，CCN2 或CCN2 mRNA 向臨近靜止或活化的HSCs 轉(zhuǎn)移，隨后靶細(xì)胞中CCN2 的濃度升高，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和膠原的表達(dá)也隨之增加，肝纖維化程度加重［18］?？梢娡饷隗w能通過Twist1-miRNA-214-CCN2 軸或直接傳遞CCN2 影響肝纖維化進(jìn)程。外泌體作為一種特殊的細(xì)胞間通訊載體，能將包含特定的功能性物質(zhì)通過運(yùn)輸、質(zhì)膜融合向臨近細(xì)胞轉(zhuǎn)移來參與肝纖維化。

目前，BA 的病毒感染學(xué)說較為普遍，也是目前研究最多的發(fā)病原因之一。除此之外，炎癥和免疫調(diào)控失調(diào)學(xué)說也備受關(guān)注。多種細(xì)胞因子均參與BA 及其肝纖維化過程。輔助性T 細(xì)胞（Treg）和Th17 細(xì)胞的發(fā)展受TGF-β1 的影響，Treg/Th17 比值越高，BA 肝纖維化程度越重［19］。TGF-β1 是肝纖維化發(fā)生過程中關(guān)鍵的細(xì)胞因子，Smad 蛋白家族是TGF-β超家族重要的細(xì)胞因子，TGF-β1/Smad2/3通路也是促進(jìn)BA 肝纖維化發(fā)生的重要通路之一。Th17 細(xì)胞參與自身免疫性疾病、炎癥反應(yīng)疾病，其分泌的IL-17 誘導(dǎo)IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）、單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白（MIP）-2 等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致肝組織和膽管組織損傷。隨著BA 肝纖維化的加重，Th17 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，分泌的IL-17隨之增加，導(dǎo)致肝組織受損加重，加速纖維化進(jìn)程。近來研究發(fā)現(xiàn)，損傷的肝細(xì)胞分泌的外泌體會(huì)激活HSCs 表面的Toll 樣受體3（TLR3），進(jìn)而通過增強(qiáng)γσ T 細(xì)胞生成大量的IL-17而加劇肝纖維化［20］。說明，外泌體不僅能作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，還能刺激炎癥細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，間接影響肝纖維化。

外泌體作為一種包含特定物質(zhì)的納米級(jí)囊泡，具有一定的生理或病理功能。近來研究發(fā)現(xiàn)，外泌體參與某些肝纖維化相關(guān)的信號(hào)通路。其中，Notch信號(hào)通路是一種由細(xì)胞接觸介導(dǎo)的進(jìn)化保守通路，Dll4是Notch的配體之一。Zagory等［21］提出Notch信號(hào)通路與BA 病理改變相關(guān)，當(dāng)HSCs 活化時(shí)，Notch信號(hào)通路就會(huì)被激活。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）能產(chǎn)生含有Dll4 的外泌體，并通過質(zhì)膜融合使Dll4蛋白實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，從而抑制Notch信號(hào)傳導(dǎo)。此外，Notch 通路與Hedgehog（Hh）通路二者相互作用調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）和間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal epithelial transition，MET），阻斷Notch通路會(huì)抑制Hh 通路并引起MET，阻斷Hh 通路同樣會(huì)抑制Notch 通路并引起MET。在發(fā)生肝硬化的動(dòng)物模型中，肌成纖維細(xì)胞-肝星狀細(xì)胞（MF-HSC）和膽管細(xì)胞釋放含有生物活性Hh配體的外泌體，尤其在膽管結(jié)扎的小鼠血漿和膽汁中，包含Hh配體的外泌體數(shù)量明顯增加［22］。這或許對(duì)我們臨床阻止EMT緩解肝纖維化提供了新的思路。

外泌體不僅能通過細(xì)胞間通訊改變靶細(xì)胞的表達(dá)，而且能夠影響受體細(xì)胞的活動(dòng)。如：外泌體能調(diào)節(jié)HSCs的遷移［20］。肝纖維化的中心環(huán)節(jié)即為HSCs的活化，只有活化后的HSCs 才能遷移至門管區(qū)，并釋放大量基質(zhì)成分或者轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白，使更多HSCs活化，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程［5］。研究發(fā)現(xiàn)外泌體能夠參與這一重要過程：當(dāng)其參與調(diào)節(jié)HSCs 遷移時(shí)，首先表面的纖維粘連蛋白（FN）誘導(dǎo)黏附HSCs，并經(jīng)過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后外泌體內(nèi)部包含的脂酶鞘胺醇激酶1（SK1）及其產(chǎn)物鞘氨醇-1-磷酸（S1P）發(fā)揮作用，趨化活化的HSCs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與遷移［23］。那么，若能夠阻止這些有助于HSCs遷移的外泌體生成，也就能降低門管區(qū)的基質(zhì)大量沉積及更多的HSCs發(fā)生活化，也許就能有效地緩解肝纖維化進(jìn)程。

4 外泌體抑制BA肝纖維化

某些干細(xì)胞來源的外泌體會(huì)通過抑制肝纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子來抵抗肝纖維化。脂肪組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）分泌的外泌體通過抑制TGF-β1緩解肝纖維化［24］。TGF-β1 是BA 患兒發(fā)生不可逆性肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子。肝臟Kuffer細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1，誘導(dǎo)HSCs 活化，活化的HSCs 同樣產(chǎn)生TGF-β1 并且上調(diào)其受體，形成自體循環(huán)，刺激纖維細(xì)胞大量增殖，加速肝纖維化進(jìn)程。TGF-β1啟動(dòng)子區(qū)域有2 個(gè)Stat3 結(jié)合位點(diǎn)，在HSCs 中Stat3 的激活啟動(dòng)了TGF-β1促纖維化，Stat3也被發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)Bcl-2的轉(zhuǎn)錄，TGF-β1通過MAPK/ERK通路增加Bcl-2的表達(dá)［25］。而ADSCs 來源的外泌體通過與臨近靶細(xì)胞質(zhì)膜融合，發(fā)生信號(hào)傳遞，使HSCs中Stat3和Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，并激活細(xì)胞自噬，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞纖維化基因表達(dá)，顯著下調(diào)肝臟Ⅰ型膠原、波形蛋白、α-SMA和纖維粘連蛋白，那么TGF-β1信號(hào)通路下游的TIMP-1和PAI-1表達(dá)也會(huì)受抑制，最終使細(xì)胞外基質(zhì)沉積明顯受抑，阻止肝臟纖維化進(jìn)程［24］。由此可見，未來干細(xì)胞來源的外泌體干擾纖維化進(jìn)程很有前景，無論是抑制相關(guān)的細(xì)胞因子活性，還是誘導(dǎo)關(guān)鍵的細(xì)胞自噬，均有待進(jìn)一步的研究探索。

外泌體能夠通過干擾BA 肝纖維化發(fā)生的重要信號(hào)通路來抵抗肝纖維化。如：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUMSC）來源的外泌體能通過滅活TGF-β1/Smad2/3 信號(hào)通路，抑制肝纖維化進(jìn)程［26］。肝纖維化初始階段，TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分增加促進(jìn)肝纖維化的重要通路之一。BA 患兒肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞表達(dá)TGF-β1 增加，Smad2蛋白在胞質(zhì)與胞核之間“磷酸化與非磷酸化”轉(zhuǎn)換效率升高，在胞質(zhì)與胞核之間穿梭傳遞促纖維化信號(hào)速度加快。經(jīng)膽管損傷等因素刺激后，TGFβ1 會(huì)與磷酸化的Smad2/3 形成絡(luò)合物，在細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、促纖維化基因轉(zhuǎn)錄速度加快，最終促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白生成，激活HSCs、活化肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程［27］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HUMSC來源的外泌體能抑制TGFβ1、Smad2 的磷酸化及TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT，導(dǎo)致經(jīng)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的纖維化肝臟質(zhì)地變軟，顯著恢復(fù)血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）活性，降低Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積［26］。需要注意的是，BA 肝纖維化機(jī)制較為復(fù)雜，TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路僅在早期纖維化進(jìn)程中作用明顯，隨著肝纖維化程度進(jìn)一步加重至肝硬化時(shí)期，該信號(hào)通路作用減弱。所以，干細(xì)胞來源的外泌體若進(jìn)一步發(fā)展用于臨床阻止纖維化進(jìn)程時(shí)，應(yīng)用時(shí)機(jī)的選擇也是至關(guān)重要的。

5 小結(jié)與展望

外泌體作為一種納米級(jí)的囊泡，內(nèi)部卻包含了豐富的分子信息，外吐小體（Exocarta）數(shù)據(jù)庫最新數(shù)據(jù)顯示，目前已確定的有9 769 種蛋白質(zhì)、3 408 種mRNA 和2 838 種miRNAs，它們是其發(fā)揮新型細(xì)胞間通訊功能的重要承擔(dān)者。哺乳動(dòng)物幾乎所有體細(xì)胞均能分泌外泌體，包括HSCs、肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等［28］。研究發(fā)現(xiàn)外泌體直接或間接地影響B(tài)A肝纖維化進(jìn)程，起到促進(jìn)或抑制作用，對(duì)未來遏制肝纖維化進(jìn)程延長BA 患兒自體肝生存時(shí)間提供一個(gè)新的方向。綜上所述，外泌體通過傳遞特定的細(xì)胞因子、配體或miRNAs；參與肝纖維化相關(guān)的信號(hào)通路；調(diào)節(jié)HSCs的遷移等來調(diào)節(jié)BA肝纖維化。相信隨著研究的不斷深入，外泌體也許能夠在BA肝纖維化發(fā)生、發(fā)展方面有新的突破。尤其值得注意的是，干細(xì)胞來源的外泌體更是具有治療前景，若能據(jù)此找出遏制肝纖維化進(jìn)程的有效手段，就能成功延長BA患兒自體肝生存時(shí)間。