間充質(zhì)干細胞聯(lián)合石墨烯支架培養(yǎng)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的研究進展

王曉東，劉愛峰，金鴻賓，李容

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)楹诵模渲饕淖兪顷P(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)環(huán)境變化，而軟骨細胞的改變也同樣起著關(guān)鍵的作用。因此，軟骨的病變是引起膝骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis of knee，KOA）重要的病理基礎(chǔ)之一，但是對于KOA患者，常規(guī)治療往往只能緩解癥狀，延緩發(fā)展，卻不能很好地恢復(fù)關(guān)節(jié)以往的功能，這是因為破損的軟骨自身很難再生修復(fù)，即便通過一些手段在結(jié)構(gòu)上可以恢復(fù)，但功能卻不能得到保留。近年來，軟骨組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一難題提供了一條新的途徑。當(dāng)前，組織工程技術(shù)主要把干細胞的分化應(yīng)用作為研究重點，并且已經(jīng)在多個臨床學(xué)科開始應(yīng)用，特別是在一些疑難重癥的治療上取得了非常好的效果［1-2］。

間充質(zhì)干細胞（MSC）作為成體干細胞的一員，具有很強的自我復(fù)制與橫向分化潛能，是多種細胞的前體細胞，此外，MSC還具有低免疫原性及對損傷組織有趨向化的特點。這些優(yōu)勢使MSC成為軟骨損傷修復(fù)的理想種子細胞［3］，目前越來越多的研究證明，將該類細胞與其他材料聯(lián)用可以發(fā)揮出更佳的治療效果。石墨烯是一種新興碳材料，能促進干細胞增殖及向軟骨分化，具有抗菌性和載藥緩釋性，在生物組織工程等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到人們的廣泛關(guān)注［4］。因此，基于KOA的病理特點、MSC對軟骨的修復(fù)能力以及石墨烯支架立體培養(yǎng)的優(yōu)勢，將三者結(jié)合起來可以為治療KOA軟骨損傷提供一種新的啟示。

1 KOA軟骨損傷機制研究

目前，比較公認的KOA的發(fā)生機制是關(guān)節(jié)軟骨合成和降解的正常偶聯(lián)作用失衡。因此，KOA的病理核心在于軟骨細胞，諸多因素可對軟骨細胞產(chǎn)生影響甚至破壞，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

膝骨關(guān)節(jié)組織內(nèi)的相關(guān)細胞因子是維持軟骨細胞以及膝關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的基本要素。一些學(xué)者通過測量膝關(guān)節(jié)軟骨以及關(guān)節(jié)液中白細胞介素（interleukin，IL）的含量發(fā)現(xiàn)，軟骨下炎癥面積同關(guān)節(jié)液中IL-1的含量呈正相關(guān)，即膝關(guān)節(jié)液中IL-1含量隨著軟骨下炎癥面積的增大而升高［5］。IL-1β由局部參與炎癥反應(yīng)的單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及其下游的反應(yīng)，降解軟骨［6］。

在KOA的病理過程中，滑膜細胞與軟骨細胞均會受累，兩者可分泌過多的MMPs，同時在各種因素的干預(yù)下，關(guān)節(jié)軟骨中的細胞外基質(zhì)成分發(fā)生游離，軟骨細胞的抗應(yīng)力能力逐漸減弱直至凋亡，從而導(dǎo)致了軟骨破壞的發(fā)生［7］。另有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α同樣參與關(guān)節(jié)軟骨中MMPs的表達，TNF-α來源于巨噬細胞，是關(guān)節(jié)軟骨降解時重要的促炎癥細胞因子，TNF-α血清表達水平與KOA病情嚴重程度呈正相關(guān)［8］。

此外，近年來人們對KOA的關(guān)注開始聚焦到基因?qū)用妗amasaki等［9］發(fā)現(xiàn)IL-1β可以造成KOA患者的關(guān)節(jié)軟骨中miR-146a基因的表達減少，進而加速關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，導(dǎo)致其正常生理功能的破壞。目前研究多認為，KOA的病理是由關(guān)節(jié)內(nèi)生化與力學(xué)環(huán)境的穩(wěn)定被破壞，而軟骨的破壞是KOA發(fā)生的核心過程，如果想徹底治療KOA甚至逆轉(zhuǎn)其病理過程，那就離不開關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨細胞的全面修復(fù)或是再生。

2 軟骨組織工程中MSC的應(yīng)用

軟骨組織缺乏血管提供的營養(yǎng)供應(yīng)，因此在其損傷后很難再生修復(fù)。目前針對軟骨缺損再生修復(fù)治療更多的是使用軟骨細胞自體移植［10］。MSC具有強大的增殖能力和多向分化潛能以及免疫重建功能，且其來源方便、易于培養(yǎng)、具有低免疫原性等。

2.1 MSC軟骨分化 MSC最初在骨髓組織中被發(fā)現(xiàn)，目前臍帶、胎盤、脂肪、滑膜等組織同樣被發(fā)現(xiàn)亦是其合適的來源，而且均具有多向分化潛力，并具有特定細胞因子的分泌功能。Zhang等［11］發(fā)現(xiàn)當(dāng)Sox9因子聯(lián)合骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC）時，可促進BMP2誘導(dǎo)的基因（Col2a1、Col10a1）mRNA表達上調(diào)，進而提高體外培養(yǎng)的BMSC的軟骨分化能力。Sasaki等［12］研究表明，粒細胞集落刺激因子（G-CSF）可以促進并誘導(dǎo)BMSC的體外增殖并向軟骨分化，并以此對受損軟骨進行修復(fù)。目前，研究多認為以BMSC的分化潛能最強［13］，但年齡因素、增殖分化能力減退因素以及取材時的損傷等會限制BMSC的廣泛應(yīng)用。Yoshimura 等［14］通過對比滑膜間充質(zhì)干細胞（synovial-derived mesenchymal stem cells，SMSC）與BMSC傳代后的差異發(fā)現(xiàn)，SMSC集落形成率、倍增速率和生長動力學(xué)高于BMSC，并且可產(chǎn)生更多的軟骨基質(zhì)，形成更好的軟骨顆粒，說明SMSC具有更強的成軟骨分化能力。此外，SMSC分化的軟骨組織具有很強的淺區(qū)蛋白合成分泌作用，可減少關(guān)節(jié)面摩擦力，對于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨組織損傷有較好的效果［15］。

2.2 MSC治療膝軟骨損傷的應(yīng)用 膝關(guān)節(jié)軟骨損傷是造成KOA最為關(guān)鍵的一環(huán)。Zhang等［16］研究發(fā)現(xiàn)，MSC外泌體在介導(dǎo)軟骨修復(fù)的過程中主要是以提高細胞增殖并減少細胞凋亡為主要特征，并且這一重塑特征是動態(tài)的，隨著時間推移，細胞的增殖呈逐步加速狀態(tài)，細胞凋亡也逐步減少，這有利于軟骨的加速修復(fù)。同時，經(jīng)外泌體處理的骨缺損處再生的軟骨也表現(xiàn)出一個再生的免疫表型，其特征是CD163+再生M2巨噬細胞浸潤多于CD86+M1型巨噬細胞，且伴隨著促炎癥滑膜細胞因子IL-1和TNF-α的相應(yīng)減少，即增加M2巨噬細胞浸潤的同時減少了M1巨噬細胞和炎性細胞因子。臨床中通常將自體收集培養(yǎng)的BMSC進行體外增殖、傳代培養(yǎng)，并將其注射至KOA患者的關(guān)節(jié)腔內(nèi)進行膝軟骨損傷治療，治療后患者的膝關(guān)節(jié)活動功能明顯改善、疼痛減輕。研究顯示，MSC治療輕中度OA有一定療效，關(guān)節(jié)腔內(nèi)培養(yǎng)的MSC可通過對炎癥的抑制及逆轉(zhuǎn)軟骨降解等途徑發(fā)揮作用［17-18］。

2.3 MSC聯(lián)合支架材料修復(fù)軟骨損傷 對于膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，無論以細胞還是生長因子為基礎(chǔ)來進行組織工程軟骨的修復(fù)與重建，在軟骨缺損區(qū)域植入支架進行搭載均是必要的。利用支架系統(tǒng)植入MSC，可在缺損空間內(nèi)進行有序的三維立體增殖培養(yǎng)［19］。利用MSC的生物調(diào)節(jié)作用所分泌的生物活性因子，可促進軟骨周圍組織細胞的增殖分化，為軟骨缺損的修復(fù)提供所需要的穩(wěn)態(tài)環(huán)境［20］；同時支架結(jié)構(gòu)的仿生表面的取向作用也有利于引導(dǎo)種子細胞的定向分布，可重新分布新生組織的力學(xué)平衡，促進軟骨在形態(tài)和功能上的恢復(fù)?？梢哉f，支架材料是軟骨組織工程應(yīng)用的橋梁，基于該種方法，MSC的使用就多了聯(lián)合多種支架材料搭載的新途徑。Sawatjui等［21］制備了絲素蛋白（SF）與透明質(zhì)酸鹽（SF-GCH）聯(lián)合使用支架，并以BMSC接種，以評估動態(tài)壓力載荷條件下聯(lián)合支架結(jié)構(gòu)的性能，結(jié)果顯示在動態(tài)壓力下BMSC有更高的糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）和膠原蛋白表達能力，說明動態(tài)壓力載荷條件下提供的軟骨周圍微環(huán)境增強了軟骨細胞的生物合成和基質(zhì)積累，提示不同力學(xué)環(huán)境對支架聯(lián)合體系的軟骨組織修復(fù)力也可產(chǎn)生不同影響。因此，支架搭載MSC可更加準確、強效地修復(fù)軟骨缺損區(qū)域，同時還可對軟骨周圍基質(zhì)力學(xué)與生化穩(wěn)態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響，創(chuàng)造有利于軟骨修復(fù)的條件。

3 石墨烯材料搭載MSC的應(yīng)用

石墨烯是近年來廣受關(guān)注的一種新型納米材料，低濃度和小尺寸的納米級石墨烯材料如氧化石墨烯（GO）等具有較好的生物相容性及安全性［22］。目前，三維石墨烯支架結(jié)構(gòu)已經(jīng)被證實具有促進MSC分化的能力，且不影響細胞的增殖作用［23］。魏麗君等［24］將氧化石墨烯與低聚乙二醇富馬酸酯水凝膠混合，并作為培養(yǎng)基質(zhì)包裹BMSC以誘導(dǎo)其向成骨分化，與單純低聚乙二醇富馬酸酯水凝膠相比，加入氧化石墨烯能更好地促進BMSC向成骨細胞分化，表明其具有更好的生物相容性，是一種良好的骨組織工程支架材料。因此，MSC可借助石墨烯材料納米級結(jié)構(gòu)網(wǎng)立體分布并培養(yǎng)在軟骨缺損區(qū)域，促進干細胞更好地修復(fù)軟骨缺損，恢復(fù)軟骨基質(zhì)外部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，進而改善KOA的病理狀態(tài)。研究認為，應(yīng)用石墨烯納米支架作為三維培養(yǎng)基質(zhì)穩(wěn)定可靠，基于石墨烯納米支架三維培養(yǎng)MSC還可調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)微環(huán)境，且既可改變膝關(guān)節(jié)力學(xué)微環(huán)境也可改善膝關(guān)節(jié)生化微環(huán)境［25］。

基于這些因素，石墨烯材料也有望搭載MSC應(yīng)用到軟骨組織工程中，近年來的一些基礎(chǔ)研究也證實了這一方法的可行性。Shen等［26］將氧化石墨烯納米片和BMSC裝入聚乙二醇（PDLLA）水凝膠中，并在沒有補充軟骨誘導(dǎo)因子的情況下評估了BMSC在石墨烯納米材料中沿著軟骨細胞譜系的分化情況：在氧化石墨烯混合水凝膠中培養(yǎng)的BMSC維持了高細胞存活率，表明氧化石墨烯的細胞毒性很小，另外，GO/PDLLA內(nèi)的BMSC的軟骨基質(zhì)基因和Ⅱ型膠原基因表達水平均有顯著提高，產(chǎn)生了更多的軟骨基質(zhì)，且隨著GO濃度的增加，向軟骨細胞分化的作用亦增強。Zhou等［27］利用生物油墨3D技術(shù)打印出有層次結(jié)構(gòu)的GO凝膠基支架，并讓BMSC在該三維有序支架上進行增殖，并向軟骨分化，結(jié)果同樣證實了GO支架結(jié)構(gòu)對誘導(dǎo)BMSC軟骨分化有促進作用，分化后的糖胺聚糖和膠原水平有明顯升高。此外，人工制造定制的GO支架具有特殊有序的組織矩陣與層次結(jié)構(gòu)，利用該特點能夠極大地提升蛋白的吸附親和力，這樣可以使那些具有促進軟骨修復(fù)作用的基質(zhì)蛋白沉積在支架表面，這有利于分化的軟骨細胞增殖和存活，并且培養(yǎng)的MSC在人工GO三維支架上的增殖分化能力越強，這一優(yōu)勢就更明顯［28］。因此，使用石墨烯支架材料，即使在不使用外源性生長因子的情況下，也可以提供MSC向軟骨細胞分化所需的生化及力學(xué)微環(huán)境的穩(wěn)定，從而為治療KOA提供一個穩(wěn)定的關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境。

石墨烯材料能夠提供軟骨細胞生長所需的支架載體，而石墨烯支架還具有將關(guān)節(jié)內(nèi)的載荷壓力分散轉(zhuǎn)移到周圍的骨骼和軟組織中的特點，原因是石墨烯具有較大的表面積，可使載荷在復(fù)合結(jié)構(gòu)中有效地傳遞開來。另一方面，石墨烯材料本身具有優(yōu)異的阻尼特性以及光滑的表面結(jié)構(gòu)，可以在膝關(guān)節(jié)腔中充當(dāng)一種固體顆粒潤滑劑使用，而軟骨的磨損是導(dǎo)致KOA的重要原因，KOA軟骨表面應(yīng)力特征也表明軟骨的修復(fù)需要受力微環(huán)境的穩(wěn)定，因力學(xué)環(huán)境的較大變化可引起軟骨下界面的開裂，進而影響缺損軟骨的修復(fù)過程［29-30］。因此，利用石墨烯材料既可充當(dāng)MSC培養(yǎng)的支架材料結(jié)構(gòu)，還可起到對關(guān)節(jié)腔的潤滑作用，減小軟骨面受到的摩擦力，為軟骨的再生修復(fù)提供穩(wěn)定的力學(xué)環(huán)境［31］。最后，利用石墨烯材料搭載MSC培養(yǎng)可使支架細胞復(fù)合結(jié)構(gòu)與關(guān)節(jié)軟骨充分接觸，填充關(guān)節(jié)缺損區(qū)域，修復(fù)軟骨及軟骨基質(zhì)，相對于傳統(tǒng)MSC治療方法其在潤滑環(huán)境與接觸面積上均有很大的優(yōu)勢，可將其看作是在膝關(guān)節(jié)封閉的關(guān)節(jié)腔內(nèi)起到類似關(guān)節(jié)液的作用的一種復(fù)合結(jié)構(gòu)，一種具有可搭載向軟骨分化能力的MSC的固體潤滑顆粒材料。

不過，目前利用石墨烯支架搭載MSC對KOA軟骨損傷模型的試驗研究還處于起步階段，無論是石墨烯材料的生物工程應(yīng)用還是MSC的軟骨組織工程均是當(dāng)前研究的熱門領(lǐng)域，相信二者的結(jié)合在早期的KOA治療中會取得真正意義上的效果。

4 結(jié)語與展望

KOA是中老年人的常見病，而且隨年齡增長呈進行性加重的趨勢，雖然當(dāng)前中西醫(yī)的臨床治療方法眾多，但均不能從根本上解除疾病的核心問題，即關(guān)節(jié)軟骨的退變損傷，更不能逆轉(zhuǎn)其病理過程。MSC具有軟骨分化能力及炎性損傷的修復(fù)能力，但是距離恢復(fù)軟骨整體功能、延緩甚至逆轉(zhuǎn)膝OA的病理過程還有很大距離。同樣，近些年來石墨烯材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，但多作為外科置換材料使用，且國內(nèi)外的基礎(chǔ)研究較少，應(yīng)用到KOA的軟骨組織工程研究中的更是稀少。不過石墨烯材料如氧化石墨烯等具有多層次、小顆粒的優(yōu)點，是理想的支架材料之一。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為，人與外界環(huán)境具有統(tǒng)一性，而軟骨與其外部的力學(xué)及生化環(huán)境同樣有相互聯(lián)系，這種聯(lián)動的穩(wěn)態(tài)是軟骨真正意義上再生修復(fù)的重要條件，應(yīng)當(dāng)內(nèi)外兼顧。因此，若將間充質(zhì)干細胞搭載到氧化石墨烯納米級結(jié)構(gòu)中，必然可以起到優(yōu)勢疊加的效果。