超臨界流體色譜法在藥物成分分析中的應(yīng)用進(jìn)展

郝桂明

(天津市藥品檢驗研究院，天津 300070)

超臨界流體色譜(SFC)的誕生可以追溯到上世紀(jì)60年代，Klesper E等首次提出這個概念，此項檢測技術(shù)在初期并未得到迅速應(yīng)用普及，主要是因為當(dāng)時的儀器設(shè)備不能精確控制檢測過程中的壓力，從而導(dǎo)致色譜分離性能的不穩(wěn)定[1]。隨著流體壓力控制以及溫度調(diào)控等技術(shù)的不斷創(chuàng)新，SFC檢測過程中的流體參數(shù)控制逐漸可以達(dá)到理想水平，因此超臨界流體色譜法逐漸與藥物成分分析相結(jié)合。這種檢測方法相比于傳統(tǒng)的GC和HPLC分析方法，能夠充分利用超臨界流體擴(kuò)散速度快、黏度較小的特點(diǎn)，因此能夠有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢測手段的缺陷。本文以超臨界流體色譜法為研究對象，不僅分析了其在手性藥物與中藥成分分析方面的應(yīng)用，同時介紹了藥物代謝產(chǎn)物成分分析領(lǐng)域中SFC的使用現(xiàn)狀。

1 超臨界流體色譜法概述

超臨界流體色譜法(SFC)是一種以超臨界流體為流動相，以固體吸附劑或高聚物為固定相的色譜分析方法。SFC相較于傳統(tǒng)普遍的高效液相色譜法(HPLC)，前者能夠在更短的時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)檢測物質(zhì)的有效分離，并且檢測過程所需的有機(jī)溶劑更少，因此逐漸受到藥物分析研究領(lǐng)域的重視。國外儀器設(shè)備廠家不斷研制出各自的SFC檢測裝置，逐步實(shí)現(xiàn)儀器設(shè)備的商品化。我國在SFC檢測裝置制造方面的起步較晚，現(xiàn)正處于從實(shí)驗室走向市場的轉(zhuǎn)化階段。陳海等[2]采用新型超臨界流體色譜儀，在優(yōu)化條件下于7 min內(nèi)完成對4種磺胺類藥物的分離并考察了色譜填料類型、共溶劑類型、共溶劑比例、背壓、流速、柱室溫度等條件對樣品保留行為的影響。

1.1超臨界流體色譜的流動相 超臨界流體指的是一種處于氣體和液體之間的特殊流體物質(zhì)，在臨界狀態(tài)下同時具有兩者的部分優(yōu)點(diǎn)。迄今為止，已確定的超臨界狀態(tài)物質(zhì)可達(dá)上千種，包括一些較為常見的氣體物質(zhì)如CO2和N2O等，以及有機(jī)物C5H12與CCl2F2等，其中最具代表性的超臨界流體是CO2。CO2實(shí)現(xiàn)超臨界狀態(tài)的實(shí)驗條件是溫度為31.1 ℃，壓力為73.8 bar，這樣的溫度和壓力條件在實(shí)驗中較容易實(shí)現(xiàn)。此外CO2本身無毒，其分子結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為非極性，因此室溫下具備很好的穩(wěn)定性。CO2之所以能夠作為典型的超臨界流體物質(zhì)，很大程度上是由于CO2能夠與多種類型的LC檢測器匹配，并且經(jīng)濟(jì)環(huán)保，可充分利用工業(yè)生產(chǎn)過程中排放的廢氣；因為該氣體在標(biāo)準(zhǔn)條件下呈現(xiàn)為氣相狀態(tài)，在分離純化CO2的過程中所需消耗的時間和能量較少。在采用SFC進(jìn)行色譜分析時，為了改善CO2對極性化合物的溶解性和洗脫力，通常需要引入適量的改性劑，例如甲醇和乙醇等極性溶劑。同時，為了提升流動相的洗脫過程以及增加其選擇性，通常會向堿性或酸性化合物中引入乙酸或三氟乙酸等物質(zhì)，這種手段既能夠有效改善待測物的峰形，又可以覆蓋固定相表面的活性位點(diǎn)[3]。

1.2超臨界流體色譜的固定相 超臨界流體色譜色譜柱的選擇是依據(jù)待測物質(zhì)的性質(zhì)來決定的，使用填充柱的稱為填充柱超臨界流體色譜法(pSFC)，使用毛細(xì)管柱的稱為毛細(xì)管超臨界流體色譜法(cSFC)。幾乎所有的HPLC色譜柱都適用于SFC色譜法，包括硅膠柱(SIL)、氰基柱(CN) 和一些手性色譜柱。超臨界流體色譜的手性固定相是在氣相和高效液相色譜固定相的基礎(chǔ)上逐步發(fā)展起來的，也是目前應(yīng)用最廣泛的固定相。市場上已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品化的手性固定相(CSPS)多種多樣，類型數(shù)量達(dá)到1 500多種，其中最為常見的是聚糖類的大分子鍵合、環(huán)糊精和大環(huán)抗生素類的大環(huán)類鍵合以及Pirkle型的小分子鍵合等。李冬艷等[4]在多糖固定相Chiralpak IA、IB、IC、ID、IE和IF上成功拆分了11 種手性化合物。實(shí)驗結(jié)果表明，這6種手性色譜柱對11種手性化合物具有良好的手性識別互補(bǔ)性，均可以在10 min之內(nèi)得到良好的分離結(jié)果。改性劑甲醇、乙醇和異丙醇對手性化合物的保留時間以及手性選擇性均具有良好的調(diào)節(jié)作用，需要根據(jù)不同手性物質(zhì)在手性柱上的分離情況加以區(qū)別，選擇使用，并調(diào)節(jié)改性劑至合適的比例。針對鍵合型固定相溶劑通用性的特征，特殊改性劑的應(yīng)用也有助于優(yōu)化手性分離。

1.3檢測器 高效液相色譜儀中經(jīng)常采用的檢測器，如紫外檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器等都能在超臨界流體色譜中很好應(yīng)用。超臨界流體色譜還可采用GC中的火焰離子化檢測器(FID)、氮磷檢測器(NPD)以及與質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)等聯(lián)用。該手段中流動相CO2不含氫元素，因此無需解決水峰抑制難題，相較于HPLC-NMR聯(lián)用方法較為簡便。

2 超臨界流體色譜法在藥物成分分析中的應(yīng)用

2.1在手性藥物成分分析中的應(yīng)用 據(jù)統(tǒng)計，手性藥物約占臨床藥物數(shù)量的一半左右。這些手性藥物的藥效不盡相同，可以分為以下四種情況：①各對映體具有相同或者相近的藥理活性；②每個對映異構(gòu)體藥理活性相同但作用強(qiáng)度卻不同；③只有其中一個對映體具有預(yù)期的藥理活性，而其他的卻沒有藥效；④各對映異構(gòu)體藥理活性不同，而且其中一個可能是其消旋體藥物不良反應(yīng)的根源。手性藥物進(jìn)入人體后，在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄中也可能表現(xiàn)出一定的立體選擇性。因此對手性藥物進(jìn)行有效拆分，對藥物的質(zhì)量控制及藥效評價具有重要的意義。

近幾年來，超臨界流體色譜法已經(jīng)成為對手性藥物的立體異構(gòu)體進(jìn)行拆分的有效方法。金薇等[5]采用Chiralcel OD 色譜柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，流動相為超臨界二氧化碳-甲醇(含0.1%三氟乙酸-0.1%三乙胺)(90∶10)，背壓設(shè)為15 MPa，于235 nm波長處分離依折麥布及其對映體。楊杰鋒等[6]采用Chiralpak OD-H 手性色譜柱，以CO2-甲醇(89∶11)為流動相，檢測波長為242 nm測定碘帕醇的對映異構(gòu)體,R-碘帕醇與S-碘帕醇分離度良好。張晶等[7]研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)化合物在SFC的分離效率要高于其在HPLC上的分離效率，但HPLC對軸手性化合物的分離效率要優(yōu)于SFC。SFC和HPLC的分離表現(xiàn)出一定的互補(bǔ)性，隨著苯環(huán)側(cè)鏈烷基的碳數(shù)增加，化合物在SFC上的保留逐漸增強(qiáng)，而在HPLC的保留卻逐漸減弱。張少敏等[8]采用ACQUITY UPC2 Trefoil CEL2 色譜柱(150 mm×3.0 mm，2.5 μm)，以超臨界二氧化碳-含0.1%三氟乙酸的甲醇(78∶22)為流動相，背壓為13.8 MPa，于244 nm波長處分離阿托伐他汀鈣及其對映異構(gòu)體。阿托伐他汀鈣與其對映體在5 min內(nèi)均已出峰完全，分離度達(dá)4.1。邸士偉[9]建立了奈必洛爾關(guān)鍵手性中間體6-氟-3，4-二氫2H-1-苯并吡喃-2-甲酸的超臨界流體色譜法,采用超臨界CO2-甲醇(75∶25)結(jié)合大賽璐Chiralpak IG(150 mm×4.6 mm,5 μm) 手性色譜柱直接拆分該手性中間體。謝依棋等[10]比較了高效液相色譜(HPLC)法與超臨界流體色譜(SFC)法拆分腎上腺素對映體。方法均使用Chiralpak AD-H色譜柱，HPLC法以正己烷-異丙醇-甲醇-三氟乙酸-乙醇胺(88∶7∶5∶0.2∶0.1)為流動相，SFC法以CO2-甲醇(含0.2%三氟乙酸和0.1%乙醇胺)(90∶10)為流動相，檢測波長均為280 nm。腎上腺素及其對映異構(gòu)體在HPLC法與SFC法中的分離度為2.95和1.86，均在0.01～0.10 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。兩種方法均可應(yīng)用于腎上腺素對映異構(gòu)體的拆分及定量，其中SFC法更加簡便、高效、綠色環(huán)保。陳香玲等[11]建立鹽酸左布比卡因注射液中異構(gòu)體的SFC測定方法。色譜柱為Chiralomix SD色譜柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)，柱溫為35 ℃，檢測波長為215 nm，流動相為超臨界二氧化碳-異丙醇(73∶27)。鹽酸左布比卡因及其右旋異構(gòu)體在0.15～1.5 μg/ml范圍內(nèi)線性良好，其中鹽酸左布比卡因與異構(gòu)體定量限均為0.15 μg/ml，檢測限均為0.075 μg/ml。Oleksandr Kozlov等[12]采用超臨界流體色譜法對一系列具有潛在抗癌活性和抗菌活性的手性吲哚類化合物進(jìn)行了對映體分離。研究了流動相中多糖骨架、共溶劑類型和共溶劑含量對吲哚類化合物的保留率、對映選擇性和對映拆分的影響。從27種受試化合物中分離出26種化合物。以直鏈淀粉為基礎(chǔ)的手性固定相比纖維素為基礎(chǔ)的手性固定相提供了更高的基線分辨率。肖夢琦等[13]采用超高效合相色譜系統(tǒng)對西替利嗪的左旋體和右旋體進(jìn)行拆分，色譜條件使用ACQUITY UPC2 Trefoil CEL1柱(50 mm×2.1 mm,2.5 μm)，改性劑為甲醇-乙腈(5∶6)在流動相中的占比為13%、添加劑為二乙胺在改性劑中的占比為0.8%(v/v)，柱溫45 ℃，背壓1 600 psi，流速為0.6 ml/min。此時西替利嗪對映體的分離度為2.107，對稱因子為1.328，分離效果好。

2.2在中藥成分分析方面的應(yīng)用 近些年來，超臨界流體色譜在中藥成分分析領(lǐng)域發(fā)揮著日益重要的作用，傳統(tǒng)的液相色譜難以準(zhǔn)確分析成分復(fù)雜多樣的中藥樣品，因而中藥有效成分的分離提取始終是相關(guān)領(lǐng)域的一項研究重點(diǎn)，超臨界流體色譜的應(yīng)用在一定程度上解決了這些問題?？红o靜等[14]將SFC用于蛇床子中香豆素類成分的分離，使用C18柱，改性劑為甲醇，并對改性劑的比例、CO2的流速、背壓和溫度等參數(shù)進(jìn)行了考查，以此得出優(yōu)化的色譜分離條件。Yang Huang等[15]采用超臨界流體色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)成功地分離了人參提取物中17種苷類和人參皂苷，系統(tǒng)地研究了各種實(shí)驗因素對分離功能的影響，如柱型、溫度和背壓、改性劑和添加劑的種類、組成溶劑的濃度等。在選定的條件下，將該方法應(yīng)用于14批不同產(chǎn)地的人參提取物的質(zhì)量評價中。呂惠生等[16]將超臨界流體色譜技術(shù)應(yīng)用于赤芍活性組分的分離。采用Zorbax SB-CN 色譜柱(250 mm×9.4 mm,5 μm)，考查了夾帶劑、CO2流量、溫度以及壓力對組分分離度的影響，得到了適宜的分離條件：夾帶劑含量13.64%，CO2流量20 g/min，柱溫313.15 K，柱壓12 MPa。此條件下可獲得純度為94.11%的芍藥苷和85.65%的芍藥內(nèi)酯苷產(chǎn)物，回收率分別為95.6%和88.3%。Jie等[17]采用SFC對親水性呋甾皂苷的分離進(jìn)行了試驗，研究了色譜條件對C-22位置上混合呋甾皂苷及其羥基衍生物分離的影響。對反應(yīng)溫度、添加劑和柱溫進(jìn)行了優(yōu)化，采用DIOL色譜柱，流動相A為CO2，流動相B為甲醇(含0.2%氨水和3%水)，梯度洗脫，在22 min內(nèi)分離出10種相似結(jié)構(gòu)的呋甾皂苷。辛華夏等[18]建立了基于反相液相制備色譜和超臨界流體制備色譜的組合方法，用于分離純化醇提水沉后石油醚層中的海風(fēng)藤。首先以甲醇作為改性劑,采用醇提水沉法去除海風(fēng)藤甲醇提取物中的葉綠素，加入硅藻土后用石油醚回流富集目標(biāo)成分。選用反相C18制備色譜柱將其分為18個組分,然后將組分在SFC模式下進(jìn)行制備。選用酰胺色譜柱,以甲醇為改性劑，在柱溫30 ℃、背壓15.0 MPa的條件下分離得到6個高純度化合物。ZhuoShun Dai等[19]采用超臨界流體色譜在線提取五味子中木脂素，實(shí)驗在15 MPa、50 ℃和4 min下進(jìn)行優(yōu)化，超臨界CO2加入1%甲醇，洗脫體積和流速分別設(shè)定為6 ml和2 ml/min，將萃取液吹出罐外，分流率為2.5%，并建立了五味子中木脂素的提取定量方法，可在19.5 min內(nèi)完成。劉蕓蕓等[20]建立超臨界流體色譜分離純化木香中的木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的方法。采用YMC-C18色譜柱(250 mm×10 mm,5 μm),流動相SC-CO2，0.13%甲醇為改性劑，背壓13 MPa，柱溫318 ℃，檢測波長225 nm，在此色譜條件下SFC分離過程為正相色譜過程。

超臨界流體色譜方法在中藥成分分離方面的應(yīng)用也得益于實(shí)驗條件的不斷提升，其中具有代表性的一項技術(shù)為超高效合相色譜(UPC2)，相關(guān)實(shí)驗儀器因此可以實(shí)現(xiàn)更加穩(wěn)定準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。王波等[21]建立了利用超高效合相色譜法(UPC2) 快速分離和測定黃芪中5種主要黃酮類化合物(毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷、芒柄花素)的方法。黃芪樣品采用80%乙醇提取后，以超臨界CO2-0.2%H3PO4-甲醇溶液為流動相，梯度洗脫，色譜柱為Waters ACQUITY UPC2 CSH 柱(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)，檢測波長為280 nm。5種黃酮類成分的檢出限及定量限范圍分別在0.3～0.5 mg/kg和1.0～2.0 mg/kg之間，加標(biāo)平均回收率均高于99.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2.2%(n=6)。袁云等[22]為了分離瓜蔞子，創(chuàng)新性地結(jié)合了離線二維反相液相色譜方法與超臨界流體色譜方法，其中前者被應(yīng)用于實(shí)驗的第一維，即按色譜峰采集樣品中制備的12個組分，后者被應(yīng)用于實(shí)驗的第二維，即將第一維得到的組分再次分離。SFC方法采用了乙醇-正己烷(3∶7)的混合溶劑作為改性劑，既提供了適當(dāng)?shù)南疵撃芰?，也保證了在上樣量增加時滿足樣品溶解的要求。

2.3在藥物代謝產(chǎn)物分析中的應(yīng)用 在進(jìn)行藥物代謝產(chǎn)物研究時，研究人員通常會采用HPLC或HPLC-MS技術(shù)。近些年來SFC技術(shù)不斷完善，其應(yīng)用于代謝產(chǎn)物成分分析也逐漸被報道。朱健等[23]在探究大鼠小腸各腸段對異甜菊醇鈉的吸收情況時引入了UPC2方法，試驗采用ACQUITY UPC2 TM BEH(100 mm×3.0 mm，1.7 μm)色譜柱，流動相A為二氧化碳，流動相B為1.5%甲酸甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，實(shí)驗時間為7 min，大大縮短了檢測周期，并且可以同時獲得較高的專屬性和靈敏度。Mariosimone等[24]首次建立了基于超臨界流體萃取與超臨界流體色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(SFE-SFC-QQQ/MS)的在線檢測方法，用于全血中類胡蘿卜素的檢測。利用現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合離子掃描和多反應(yīng)檢測進(jìn)行定性，并采用改進(jìn)的方法對β-隱黃質(zhì)、玉米黃素、β-胡蘿卜素和辣椒紅素進(jìn)行定量分析。Solfrid等[25]用UHPSFC-MS/MS建立了血清中R/S-西酞普蘭對映體分離和定量的方法。試驗采用UPC2 Trefoil CEL2色譜柱，流動相為二氧化碳-10 mM醋酸銨的甲醇溶液(70∶30)，進(jìn)樣量為1 μl，運(yùn)行時間為4 min，線性范圍為5～500 nM，RSD為3.4%～4.5%，回收率為81%～91%。S J Kumari A等[26]建立了一種簡單、快速、環(huán)保的超臨界流體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，可同時測定生物樣品中5個AA代謝物(PGD2、PGE2、PGF2α、6KetoPGF1α和 LTB4)。線性范圍為0.5～100 ng/ml(R2≥0.995)，PGD2、PGE2、 PGF2α和LTB4的定量限均為0.5 ng/ml，6KetoPGF1α的定量限為2.5 ng/ml。方法的日內(nèi)和日間精密度均小于15%，準(zhǔn)確度在83%～109%。WeiPing Wang等[27]建立了一種簡單、靈敏、高效的超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定比格犬血漿中尼莫地平的方法。用丙酮沉淀蛋白質(zhì)，從血漿中提取分析物，以尼群地平為內(nèi)標(biāo)物。采用Acquity UPC2TMBEH2-EP色譜柱，以1.5 ml/min的流速梯度洗脫。應(yīng)用多重反應(yīng)監(jiān)測尼莫地平的m/z419.3→301.3和尼群地平的m/z361.4→315.2的轉(zhuǎn)變進(jìn)行定量。

3 展望

近年來，作為GC和HPLC的重要補(bǔ)充技術(shù)，超臨界流體色譜在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛。隨著 SFC 儀器設(shè)備的逐步商業(yè)化及大量的手性固定相的研發(fā)和應(yīng)用，快速高效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的超臨界色譜法及其與質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)等聯(lián)用技術(shù)給藥物成分的定性與定量分析開辟了一條新的思路。