以腸道菌群為靶向的糞菌移植法及其在畜牧業(yè)的應用潛能

李曉蕾，李地艷，孫靜

(1. 重慶市畜牧科學院農業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室； 2. 重慶市養(yǎng)豬科學重點實驗室； 3. 重慶市醫(yī)用動物資源開發(fā)與利用工程技術研究中心，重慶 402460； 4. 四川農業(yè)大學動物遺傳育種研究所，成都 611130)

哺乳動物腸道內，每克腸內容物中菌落總數(shù)達到1010～ 1012，種類超過1000個[1-2]，微生物與宿主共同進化，對機體代謝、免疫系統(tǒng)功能和腸道內穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用[3]。菌群在宿主體內定居、生長和繁殖的現(xiàn)象稱之為定植，正常定植的細菌群稱為共生菌[4]，對宿主的主要作用是：(1)與腸黏膜緊密粘附，維持腸黏膜的屏障功能，產生定植抵抗力，阻礙致病菌在腸道內過度繁殖對宿主的侵襲及毒害作用[5-6]。(2)與固有免疫和適應性免疫反應間存在雙向介導作用，能有效刺激、誘導宿主的免疫反應[7]。(3)直接參與或間接調節(jié)宿主腸道內的物質代謝過程，合成機體所需的物質，對宿主產生營養(yǎng)作用和益生作用[7-8]。腸道共生菌間逐漸形成相互依賴與制約的平衡共生狀態(tài)。一旦腸道共生菌菌群失衡，機體的健康狀況將會受到嚴重的威脅[9-10]。

醫(yī)學上，通過糞便微生物群移植(fecal microbiota transplantation, FMT)重構腸道微生態(tài)失衡患者的腸道菌群可達到治療相關疾病的目的。FMT在治療多種腸道疾病上表現(xiàn)出良好效果[11-14]。另外，一系列研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物與腸道外相關疾病如：神經系統(tǒng)性疾病(包括焦慮癥、自閉癥等)和代謝相關性疾病(肥胖癥、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、糖尿病等)緊密相關[15-22]。FMT作為一種以腸道微生物為靶向的治療方法，可能對這些疾病的深入研究和治療具有一定價值。通過FMT對新生仔豬腸道菌群進行早期干預，可以改善仔豬腸道健康水平，降低腹瀉率、提高生產性能[23-24]。在動物上的相關研究提示了FMT在畜牧獸醫(yī)學研究上的應用潛能。

1 FMT技術的發(fā)展歷程

早在1700年前葛洪《肘后備急方》就有關于人糞清治療食物中毒、嚴重腹瀉的記載[25]；16世紀，李時珍《本草綱目》也記載了用人糞便治病的方法[25]；17世紀，F(xiàn)MT在獸醫(yī)學領域用于治療反芻動物和馬胃腸道疾病[26]；1958年，Eiseman等[27]采用糞便灌腸的方法治療假膜性結腸炎，并對FMT進行了描述；1983第一次報道FMT用于治療艱難梭菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)[28]；2012年，Khoruts等[29]制定出人類醫(yī)學上用FMT治療復發(fā)性CDI的推薦標準和方法，為FMT技術的標準化提供了參考。2013年，美國食品藥物監(jiān)管局針對FMT治療CDI實施“執(zhí)法自由裁量權”政策，基本上允許了FMT在CDI治療上的使用[30]；2017年，歐洲FMT在臨床中應用的共識會議上，專家們就人類醫(yī)學FMT技術的參考標準達成了共識[31]。2017年，胡軍等[32]首次制定了我國豬FMT技術的標準程序，并對相關方法、程序和步驟進行了詳細描述，這對豬FMT的運用和發(fā)展具有指導意義。

2 FMT的應用研究

2.1 FMT用于治療腸道相關性疾病

腸道菌群失衡是引發(fā)腸道感染的重要原因，F(xiàn)MT在治療多種腸道疾病上表現(xiàn)出良好效果。Khoruts等[33]對CDI病人通過結腸鏡進行FMT治療，患者腹痛、腹瀉癥狀逐漸減輕最終消退，F(xiàn)MT一個月后患者糞便艱難梭菌檢測為陰性，六個月后糞便呈正常固態(tài)。Yamazaki等[34]用甲硝噠唑、恩諾沙星治療絨猴腹瀉，臨床癥狀雖得到緩解，但均復發(fā)，癥狀加劇，對糞便進行檢測后發(fā)現(xiàn)絨猴腹瀉是因CDI所引起，此后研究者將健康絨猴的糞便投喂給病絨猴實施FMT，連續(xù)FMT治療4 d后腹瀉停止，且10個月內無復發(fā)現(xiàn)象。Wang等[14]對139名克羅恩病患者進行FMT，經過長期追蹤統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：FMT后有20人出現(xiàn)排便頻率增加、發(fā)熱、腹痛、腸胃氣脹、便血、干嘔、腹脹、和帶狀皰疹的不良反應，有不良反應患者最終的臨床反應率和臨床緩解率分別為45%和20%；未出現(xiàn)不良反應的患者的臨床反應率和臨床緩解率分別為75.6%和63%。有研究報道對潰瘍性結腸炎和克羅恩病人進行FMT有一定療效，患者癥狀得到緩解，且緩解得到長期維持[12-13]。90%腸易激綜合癥(irritable bowel syndrome，IBS)患者在FMT后排便情況得到改善，腹脹減輕，同時60%的患者在9 ～ 19個月內保持了癥狀改善[35]。多項研究認為腸道菌群紊亂引發(fā)腸道疾病的潛在機制可能是通過改變腸屏障功能、胃腸道蠕動、腸-腦軸，誘發(fā)內臟超敏反應等[7, 36-37]。

2.2 FMT用于研究或治療腸道外相關性疾病的潛能

2.2.1 腸道菌群與神經系統(tǒng)性疾病

腸道微生物在調節(jié)中樞神經系統(tǒng)功能和活動方面有著重要作用，與無特定病原體(specific pathogen free，SPF)小鼠相比，無菌小鼠的血腦屏障滲透性增強，通過FMT把正常小鼠的腸道菌群移植到無菌小鼠腸道內后該小鼠的血腦屏障滲透性降低[38]。此外，腸道微生物對大腦神經小膠質細胞的成熟和功能有著重要作用[39]。研究者提出了雙向“腦-腸道-微生物軸”的理念，該軸的破壞將引起神經性行為異常，誘發(fā)神經性疾病[40-41]。Giada等[15]將IBS患者的糞便微生物移植給無菌小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠腸轉運速度加快、腸腔滲透性增加，產生免疫激活反應，且IBS患者的焦慮癥也轉移到小鼠上，使小鼠表現(xiàn)出類似的“焦慮”癥狀。研究證實，IBS患者的焦慮癥、抑郁癥與免疫激活相關[42]。這提示腸道定植的微生物可能是引起IBS患者并發(fā)焦慮癥的因素之一。自閉癥患者腸道菌群組成異常，通常伴隨出現(xiàn)胃腸道疾病，腸道微生物對這一疾病的發(fā)生可能起著重要作用[16]。

2.2.2 腸道菌群與代謝性疾病

肥胖是全球性流行病，瘦和胖的個體間的腸道菌群存在顯著差異[43]。通過脂多糖依賴性炎癥機制，腸道微生物能引發(fā)肥胖相關代謝性疾病[44]。有研究者對普通鼠和無菌鼠高脂飲食飼喂，無菌鼠能免于肥胖的發(fā)生[17]。深入研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物通過調控與脂肪代謝相關基因(如：快速誘導脂肪因子[45]、大麻素1受體[18])、酶(如蛋白激酶)[17]的表達調節(jié)機體脂肪沉積。酒精性脂肪肝患者因過度攝入酒精造成腸道菌群失衡、腸屏障受損，使得細菌或細菌產物從腸腔移位到肝臟，誘導氧化應激引起肝細胞損傷[19-20]。一些研究報道，腸道菌群的改變與糖尿病的發(fā)展有關[21-22]。

鑒于腸道微生物是引起神經性疾病和代謝性疾病的風險因素，F(xiàn)MT作為一種以腸道微生物為靶向的治療方法，可能對這些疾病的深入研究和治療具有一定價值。

3 FMT在畜牧業(yè)中的潛在價值

哺乳動物生命早期存在一個共生菌定植的關鍵時期，腸道內微生物的早期定植對宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育和訓練具有重要且深遠的影響，并對宿主疫病耐受性產生重要作用[46]。利用FMT技術使幼齡動物盡早接觸有益微生物，可能達到訓練宿主動物免疫系統(tǒng)、增強其抗病能力的目的。腸道共生菌群被報道能改善畜禽胃腸道健康水平，并利于提高飼料消化率和動物的生產性能[47]。Cheng等[8]發(fā)現(xiàn)，仔豬FMT后可調節(jié)其結腸微生物的多樣性和結構，進而影響微生物介導的物質代謝過程，減輕腸屏障損傷。有研究發(fā)現(xiàn)FMT可以改變新生仔豬腸道菌群結構，促進腸黏膜發(fā)育，從而改善豬的腸道健康[23]，還有助于降低腹瀉率，增加仔豬平均日增重，改善仔豬生長狀況[24]。在畜牧業(yè)中，動物疾病防重于治。益生菌有助于逆轉腸道菌群紊亂，對宿主的免疫、代謝、生長發(fā)育產生積極影響[48]，被廣泛運用于畜牧業(yè)中。但是益生菌因種類和數(shù)量有限，以及作用表現(xiàn)出宿主差異性等因素則制約了益生菌的長期有效性[47, 49]。相比之下，健康供體糞便中有完整的菌群結構，還有蛋白質、膽汁酸、維生素等物質可能更有助于恢復腸道功能[50]。同時，F(xiàn)MT與益生菌發(fā)揮作用的機理相似，使之不僅可行，且可能在治療復發(fā)性胃腸道疫病上優(yōu)于益生菌，有望作為一種新興手段以緩解仔豬腹瀉等養(yǎng)豬業(yè)難題。

由抗生素誘發(fā)的耐藥性及耐藥性致病菌的傳播、食物中抗生素殘留問題日顯嚴峻[51]，抗生素在畜牧業(yè)中正逐漸被禁止使用[52]。因此，尋找抗生素替代品對畜牧業(yè)和食品安全具有重要意義。FMT用于降低抗生素在畜牧業(yè)上使用的潛能不可忽視。Victor等[51]通過糞菌移植治療艱難梭菌感染，清除了95個耐藥性基因，尤其是清除了一些與臨床相關的耐藥性基因如：耐超廣譜β-內酰胺酶、耐喹諾酮的抗性基因。這提示FMT可能成為移除腸道多重耐藥性細菌的新方法。我國養(yǎng)豬業(yè)中因抗生素濫用導致菌群多重耐藥性問題的同時也可能會破壞豬腸道微生態(tài)平衡，而腸道菌群失衡是引起仔豬斷奶后腹瀉和腸道感染的重要因素[53]。越來越多FMT臨床研究提供的有效證據(jù)表明，重構腸道正常微生物群是治療腸道菌群紊亂相關腸道疾病的有效方式。以畜禽腸道菌群為靶點，采用糞菌移植技術盡快建立或恢復畜禽動物腸道微生態(tài)平衡，似乎將是一種相對安全有效的非抗生素藥物手段，用于防治腸道菌群紊亂相關的疾病。

4 FMT應用于畜牧業(yè)的制約因素及其展望

目前，F(xiàn)MT應用于畜牧業(yè)還需要解決不少難題，包括供體糞便的篩選、給藥方式、有效劑量、最佳給藥時間、療效和安全性評估、成本預算等問題。主要制約因素如下：(1)FMT是一個系統(tǒng)繁瑣的過程，技術操作的復雜性以及專業(yè)性可能制約著它在畜牧業(yè)中的推廣與應用。(2)供體糞便中的某些菌群可能決定著FMT的成功治療，但因缺乏有效的評估手段和技術，其有效性仍難預測。(3)FMT的安全性還有待進一步探究，比如移植后受體可能出現(xiàn)不適反應，如低燒、腹痛、腹瀉、胃腸脹氣、易疲勞等[54]，類似副作用是否也在受體畜禽動物上表現(xiàn)出來，其嚴重程度是否威脅其生長或生產性能，至此仍是未知；糞便中的代謝物和其他物質對受體及其腸道菌群的影響還不清楚，考慮到畜禽是人類的主要食品來源，動物進行FMT后對畜產品是否存在安全隱患還沒有最終定論。因此，一方面，F(xiàn)MT應用于畜牧生產時應制定更為謹慎的供體及供體糞便篩選標準以減少致病菌和條件病原在FMT過程中的交叉?zhèn)鞑?，挑選的供體最好沒有使用過抗生素或易殘留藥物的歷史(比如，SPF動物)，以避免受體被潛在的抗生素和藥物殘留污染。另一方面，腸道菌群是一個由眾多組分構成且還未被特征化的復雜群體，目前尚不能完全闡明將菌群從一個個體轉入另一個體所產生的影響，在研究過程中有必要系統(tǒng)的收集關于FMT有效性的信息包括長期或短期安全性的數(shù)據(jù)，記錄受體經FMT后的臨床相關反應，包括益處和弊端并進行定義和監(jiān)控。 這對于FMT移植的安全性有效性追溯、潛在機制研究具有重要的參考價值。

隨著高通量測序技術的發(fā)展，如：16 s rRNA擴增子測序、宏基因組測序技術廣泛用于研究特定生態(tài)環(huán)境下微生物群將為我們深刻認識腸道微生物擴展深度。此外，分析手段的完善和動物模型的構建將有助于深入探究腸道微生態(tài)失衡致病的病理機制，并推動FMT在某些疾病治療上的應用。通過傳統(tǒng)和現(xiàn)代微生物學的完美結合，發(fā)現(xiàn)新的菌種及它們的功能，未來有望針對不同的個體需求或不同疾病治療目的合理配伍菌群，通過個體化治療來達到最佳益生作用。

5 結語

腸道菌群在宿主健康中發(fā)揮著重要作用，以腸道菌群為靶點是進行相關疾病防治的新思路。目前，亟需解決FMT標準化、規(guī)范化、安全性評估等問題。通過揭示腸道菌群在健康與疾病中產生作用的機制，并不斷改進和完善FMT的關鍵技術，將對進一步深入研究FMT治療人類和動物相關疾病具有重要意義。

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