幾種常見的細(xì)小病毒病毒樣顆粒研究進(jìn)展

董 浩,姜 萌,楊一鳴,張林波,張文慧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

致病性細(xì)小病毒大多為單股DNA病毒[1],分類地位主要集中在細(xì)小病毒科,按國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)編寫的分類報(bào)告,根據(jù)各種細(xì)小病毒侵染的宿主不同,可將細(xì)小病毒科分為兩個(gè)亞科,分別是侵染脊椎動(dòng)物的細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae)和侵染昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物的濃核病毒亞科(Densovirinae)[2]。近年來流行較為嚴(yán)重的犬、豬和鵝等細(xì)小病毒均具有很強(qiáng)的破壞力,傳統(tǒng)疫苗的控制較為有限,加大新型疫苗的研制刻不容緩。

病毒樣顆粒(VLPs)是一種不含有病原核酸,只通過病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白組成的空心顆粒[3]。其不能進(jìn)行自我復(fù)制,只是在形態(tài)上與病毒相似,可以通過感染模式把抗原遞呈給免疫細(xì)胞,有效的誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能,產(chǎn)生保護(hù)作用。目前活病毒疫苗的主要不足就是安全性不能完全保證,因此對(duì)于傳染病的防護(hù)VLPs有著傳統(tǒng)疫苗不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

1 VLPs的結(jié)構(gòu)及免疫機(jī)制

VLPs是通過病毒的1個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白裝配形成的具有一定規(guī)則(通常為二十面體或桿狀)的超分子結(jié)構(gòu),直徑在25 nm～100 nm之間。病毒的結(jié)構(gòu)蛋白與包膜的結(jié)構(gòu)特征決定了VLPs的免疫原性和抗原性。VLPs的特點(diǎn)是可以多層重復(fù)且高密度的把病原相關(guān)分子模式(PAMPs)展現(xiàn)出來,可以通過PAMPs激活固有免疫反應(yīng),被宿主細(xì)胞中的各種識(shí)別受體所識(shí)別,隨后刺激巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞進(jìn)行抗原捕獲,最后遞呈給MHCⅡ類分子,激活一系列的免疫應(yīng)答。一些外源性VLPs仍保留與原始病毒相近的受體結(jié)合位點(diǎn),可以通過交叉遞呈的方式通過MHCⅠ類途徑進(jìn)行遞呈,使CD8+T細(xì)胞活化,實(shí)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)性免疫反應(yīng),這樣可以更容易清除細(xì)胞內(nèi)的病原體。另外,VLPs可通過交聯(lián)B細(xì)胞膜表面免疫球蛋白從而誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng),還可有效刺激CD4+T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。在某些情況下,VLPs可以直接激活B細(xì)胞受體和刺激T細(xì)胞非依賴性IgM反應(yīng)。因此,只需要低劑量的VLPs就可以使免疫系統(tǒng)激活保護(hù)反應(yīng),從而顯著的降低了疫苗的成本[4]。在疫苗安全方面,VLPs不含有病毒的核酸,從而消除了活病毒重現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn),不會(huì)造成具有活力的病毒傳播,疫苗也不存在毒力返祖、產(chǎn)生免疫缺陷等風(fēng)險(xiǎn)。VLPs除了疫苗功能以外,還可以作為一種抗原遞呈載體,不同種的病毒結(jié)構(gòu)基因通過基因工程手段整合到一起形成病毒樣顆粒(VLPs),單個(gè)VLPs上嵌合多個(gè)免疫原性較低的可溶性抗原可以有效提高可溶性抗原的免疫原性。還可以,分別表達(dá)外源抗原和VLPs,然后通過化學(xué)方法以共價(jià)或非共價(jià)的方式將其偶聯(lián)至VLPs表面,也可以設(shè)計(jì)外源抗原的結(jié)合位點(diǎn),這些抗原包括環(huán)肽、短肽等蛋白抗原以及半抗原、多糖等非蛋白抗原[5]。

2 細(xì)小病毒VLPs的研究現(xiàn)狀

目前,國(guó)內(nèi)外主要集中在以下細(xì)小病毒的VLPs研究：犬細(xì)小病毒(CPV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、人細(xì)小病毒B19(B19)、鵝細(xì)小病毒(GPV)等病毒的研究。

2.1 犬細(xì)小病毒VLPs的研究進(jìn)展 犬細(xì)小病毒是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員,具有細(xì)小病毒屬病毒典型形態(tài)和結(jié)構(gòu)[6]。CPV可引起犬急性出血性腸炎和急性心肌炎,發(fā)病率和病死率高,對(duì)犬及狐等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物具有極大的危害。CPV是一類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的線狀單鏈DNA病毒,形態(tài)呈六角形或圓形,等軸對(duì)稱的二十面體,直徑約為20 nm,衣殼蛋白無囊膜,不含脂質(zhì)或糖類[7]。

CPV VLPs的制備通常是利用病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2表達(dá)后組裝而獲得的。目前常用的表達(dá)體系主要分為真核表達(dá)體系和原核表達(dá)體系,真核包含昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng),而原核主要是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。目前比較成熟的CPV VLPs利用真核表達(dá)系統(tǒng)的為多,主要原因是真核系統(tǒng)有利于實(shí)現(xiàn)外源蛋白翻譯后的修飾和折疊,表達(dá)的重組VP2結(jié)構(gòu)蛋白具有天然的分子構(gòu)象,利于VLPs的形成。Feng[8]等利用CPV的VP2蛋白在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá),并在昆蟲細(xì)胞和蛹中組裝成病毒樣顆粒。VLPs的電子顯微照片顯示,與野生型細(xì)小病毒相比,它們的大小和形態(tài)非常相似。同時(shí),該學(xué)者又在小鼠和狗中研究了VLPs的免疫原性,結(jié)果表明,CPV-VLPs刺激細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。Xu[9]等利用小泛素樣修飾(SUMO)融合模序在大腸桿菌中表達(dá)CPV的整體天然VP2蛋白,在融合模序切割后,CPV VP2蛋白自組裝成VLPs,獲得的VLPs具有類似真實(shí)病毒衣殼的大小和形狀。免疫試驗(yàn)結(jié)果表明,VLPs可以有效地誘導(dǎo)抗CPV特異性抗體和淋巴細(xì)胞增殖。另外,也有學(xué)者利用CPV VLPs作為生物載體來應(yīng)用,王斌[10]利用PCR的方法將犬細(xì)小病毒的衣殼蛋白VP2基因擴(kuò)增鏈接到pSMK載體質(zhì)粒上,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)得到可溶性的VP2蛋白,然后自組裝成病毒樣顆粒特性。在體外環(huán)境下,以VLP為原料將MPA修飾后的量子點(diǎn)MPA-QDs包裹進(jìn)入病毒樣顆粒內(nèi)部,形成具有良好生物相容性,且無生物毒性的熒光復(fù)合物 CPV VLPs-QD。

2.2 豬細(xì)小病毒VLPs的研究進(jìn)展 豬細(xì)小病毒所致的繁殖障礙是世界養(yǎng)豬業(yè)面臨的問題,一旦病毒侵入易感豬群,發(fā)病率非常之高。PPV是單股負(fù)鏈DNA病毒,無囊膜,病毒粒子大小22 nm～25 nm,由60個(gè)衣殼蛋白亞基組成,結(jié)構(gòu)呈二十面體等軸對(duì)稱[11]。PPV基因組大小約5.0 kb,末端約有120 bp～200 bp的回文結(jié)構(gòu)[12]。

PPV的VLPs制備也主要從結(jié)構(gòu)基因VP2表達(dá)蛋白入手,常用的表達(dá)體系主要包含酵母表達(dá)體系,比如Tamosiunas[13]等使用來自豬血清的病毒核酸提取物擴(kuò)增編碼PPV主要衣殼蛋白VP2的基因,并將其插入到釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒中,重組PPV VP2蛋白在酵母中有效表達(dá),純化后的PPV VP2蛋白的電子顯微鏡分析顯示病毒樣顆粒(VLP)自組裝。產(chǎn)生針對(duì)重組PPV VP2蛋白的9種單克隆抗體(MAb)。通過PPV感染細(xì)胞的免疫熒光分析證實(shí)了新產(chǎn)生的MAb的特異性。利用間接ELISA進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果表明,具有很高的靈敏度和特異度。另外也有通過桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系進(jìn)行組裝的,Antonis[14]等用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)產(chǎn)生的由重組病毒樣顆粒(PPV-VLP)組成的針對(duì)豬細(xì)小病毒(PPV)的新型疫苗,測(cè)試其免疫原性和保護(hù)效力,結(jié)果表明,在礦物油佐劑中的亞微量的PPV-VLP的制劑在用作參考模型的豚鼠和目標(biāo)物種豬中誘發(fā)高血清抗體滴度。再有,PPV VLPs可以與外源抗原嵌合,為開發(fā)預(yù)防和控制豬病的多聯(lián)苗提供了可能,陳楊[15]等采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將PPV VP2與豬偽狂犬病病毒DNA共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,重組病毒PRV SA215/VP2株,電鏡觀察表明,感染的Vero細(xì)胞中可同時(shí)觀察到PRV與PPV兩種類病毒樣顆粒,成功實(shí)現(xiàn)了利用PRV載體表達(dá)PPV VP2蛋白病毒樣顆粒。

2.3 人細(xì)小病毒B19 VLPs的研究進(jìn)展 人細(xì)小病毒B19顆粒直徑為23 nm,無囊膜包裹,病毒基因組是由3 500個(gè)堿基組成的單鏈DNA,B19病毒在分子生物學(xué)上有獨(dú)特性,末端回文序列長(zhǎng)達(dá)365個(gè)堿基,G、C含量高,使得B19病毒二級(jí)結(jié)構(gòu)牢固,而不易克隆入細(xì)菌中。B19病毒同其他小DNA病毒一樣有種屬特異性。有兩種殼蛋白：VP1(83 kDa)和VP2(58 kDa),VP2占優(yōu)勢(shì),VP1位于殼體外部,易與抗體結(jié)合。

B19病毒的組裝既可以在真核表達(dá)體系中完成,也可以在原核表達(dá)體系中完成。鄒小輝[16]等采用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng),成功制備了人細(xì)小病毒B19病毒樣顆粒,在透射電鏡下可見直徑約22 nm的VLPs。Sanchez-Rodriguez[17]等報(bào)道了在大腸桿菌中表達(dá)的重組VP2蛋白的B19 VLP的體外自組裝以及pH值和離子強(qiáng)度對(duì)組裝過程的影響,研究結(jié)果表明,VP2能夠在體外完全形成VLP。在中性pH值下,均勻的VLPs在酸性和堿性pH值下組裝,離子強(qiáng)度低,主要組件是小型中間體。體外自組裝的VLPs在37℃下是高度穩(wěn)定的,并且在80℃下30分鐘后,大部分顆粒保持組裝。B19病毒也被用來作為異源DNA的載體,在藥物和其他生物分子醫(yī)學(xué)成像中有著很大的應(yīng)用前景,Sanchez-Rodriguez[18]等將不同大小的異源線性dsDNA片段封裝到B19 V-VP2 VLP中的,其中將DNA和變性VP2蛋白共孵育,并通過一次透析步驟進(jìn)行裝配過程,開啟了使用這種VLP作為具有未來治療應(yīng)用傳遞系統(tǒng)的可能性。

2.4 鵝細(xì)小病毒VLPs的研究進(jìn)展 鵝細(xì)小病毒GPV直徑20～22 nm、無囊膜、二十面體對(duì)稱的病毒,在分類學(xué)上屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae),細(xì)小病毒亞科(Parvovirinae),依賴病毒屬(Dependovirus)的成員,GPV基因組全長(zhǎng)約為5.2 kb,為單鏈、線性DNA。GPV基因組的一大特點(diǎn)是正負(fù)鏈DNA分子都具有回文序列。GPV總共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白,分別是VP1、VP2和VP3。

GPV的VLPs的獲得多采用真核表達(dá)體系。Ju.H[19]等通過PCR擴(kuò)增了GPV VP的基因,并使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)重組VPs蛋白,電子顯微鏡顯示在昆蟲細(xì)胞中自發(fā)組裝成VLPs,免疫實(shí)驗(yàn)也證明獲得的VLPs具有較好的免疫原性。Chen.Z[20]等將野生型VP2密碼子轉(zhuǎn)化為在昆蟲基因中更常見的密碼子,使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(BES)表達(dá)GPV的主要衣殼蛋白VP2組裝成病毒樣顆粒(VLP)。透射電鏡結(jié)果顯示VLP的形成,免疫原性測(cè)定結(jié)果顯示,VLP是高度免疫原性的,引起高水平的中和抗體并提供針對(duì)致死性攻擊的保護(hù)。

3 展望

細(xì)小病毒的VLPs主要由病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP2自組裝備成的不含遺傳物質(zhì)的空心顆粒,由于沒有DNA,病毒無法復(fù)制和增殖,也就不具備感染致病的能力,因此安全性也是傳統(tǒng)的活疫苗和弱毒苗所不能比擬的。另外由于VLPs可以出色的模擬病毒粒子的結(jié)構(gòu),與天然病毒具有相同的免疫原性,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫反應(yīng)。因此VLPs作為一種未來的新型疫苗是值得期待的。但目前在顆粒制備上也存在一些技術(shù)難題,不管是哪種表達(dá)體系,獲得VLPs的過程就較繁瑣,獲得率又很低,這阻礙了病毒樣顆粒疫苗向臨床試驗(yàn)的轉(zhuǎn)化,因此開發(fā)新型的表達(dá)體系,探索影響表達(dá)系統(tǒng)VLPs組裝過程的影響因素,是目前最為重要的研究方向。此外,VLPs的生物載體特性也得到了很好的應(yīng)用,通過化學(xué)偶聯(lián)或者生物包被等方式把異源基因,藥物,量子點(diǎn)及納米顆粒等整合到VLPs上,為研究生物靶向治療和生物納米成像等方面提供材料。