抗菌肽基因工程表達(dá)載體的研究進(jìn)展

朱春玲,李 梅,劉 麗,劉少龍,夏小靜,王 青,徐彥召,杭柏林,孫亞偉,胡建和,王 磊

(河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來,由于傳統(tǒng)抗生素的濫用,藥物殘留及耐藥性問題日益嚴(yán)重,時(shí)刻威脅著人類的健康,尋找新的抗菌藥物迫在眉睫?？咕氖且活惙肿恿肯鄬?duì)較小并由基因編碼核糖體合成的生物活性肽[1]。Boman G.等人發(fā)現(xiàn)第1個(gè)天然抗菌肽天蠶素以來,便開啟了抗菌肽研究的黃金時(shí)代。隨著抗菌肽研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗癌、調(diào)節(jié)凋亡以及加快傷口愈合的功能。然而,天然抗菌肽的生產(chǎn)成本高、細(xì)胞選擇性差,限制了天然多肽在臨床上的應(yīng)用[2],另外,如何進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)和純化仍是限制抗菌肽開發(fā)的技術(shù)瓶頸。為充分提高抗菌肽的利用效率,基因工程技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到抗菌肽的研發(fā)過程中,在本文中,我們將對(duì)抗菌肽真核表達(dá)系統(tǒng)、原核表達(dá)系統(tǒng)和人工設(shè)計(jì)化學(xué)合成等進(jìn)行綜述,以期為抗菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 真核表達(dá)系統(tǒng)

1.1 酵母表達(dá)系統(tǒng) 目前,已有500多種外源蛋白在酵母表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá),Sang M[3]等為探究ABP-Dhc-cecropin A線性陽離子肽表達(dá)的新方法,將ABP-Dhc-cecropin A基因重組到pPICZ αA載體上,通過電擊的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母體內(nèi),在適宜培養(yǎng)條件下成功表達(dá)了濃度為48 mg/L的ABPDhc-cecropin A線性陽離子肽。Xing L W[4]研究發(fā)現(xiàn)Fowlicidins是雞體內(nèi)一組重要的抗菌肽,在雞先天免疫中具有防御作用,并廣泛表達(dá)在各個(gè)組織中。為獲得大量的Fowlicidins,該實(shí)驗(yàn)組人員將畢赤酵母X-33與表達(dá)載體pPICZ αA重組,成功構(gòu)建攜帶Fowlicidin-2基因的表達(dá)系統(tǒng),在優(yōu)化的發(fā)酵條件下Fowlicidin-2的濃度可達(dá)85.6 mg/L,純度大于95%。Lui D P[5]等人完整的設(shè)計(jì)了一個(gè)抗菌肽Abaecin,并對(duì)其密碼子進(jìn)行優(yōu)化,通過pPic9表達(dá)載體,將Abaecin基因亞克隆至畢赤酵母基因組內(nèi),甲醇誘導(dǎo)激活,結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組表達(dá)的Abaecin可以有效抑制大腸桿菌的生長。畢赤酵母等真核表達(dá)體系具有翻譯后的加工修飾功能,表達(dá)的蛋白更接近于天然蛋白,能夠克服原核表達(dá)系統(tǒng)低表達(dá)包涵體的缺點(diǎn),目前,利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)行了多種抗菌肽的表達(dá)。然而,畢赤酵母等真核表達(dá)體系也存在缺陷,比如產(chǎn)物復(fù)雜,不易純化,且表達(dá)的成本較高。

1.2 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)由于其高效性已被廣泛使用。轉(zhuǎn)基因植物疫苗和藥用蛋白的表達(dá)系統(tǒng)有很多,其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物表達(dá)系統(tǒng)、植物病毒瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)以及葉綠體表達(dá)系統(tǒng)最為常用。目前轉(zhuǎn)基因植物在生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蛋白質(zhì)方面具有相當(dāng)大的市場(chǎng)潛力,而且轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)的藥物在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出低免疫原性[6]。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物表達(dá)系統(tǒng)是一種利用天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng),具有表達(dá)成功率高和產(chǎn)物活性好的優(yōu)點(diǎn)。Lee l H[7]等人將人類的LL-37多功能抗菌肽基因通過pPZP載體引入農(nóng)桿菌基因組中,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)作用將目的抗菌肽基因轉(zhuǎn)入水稻中,結(jié)果表明,LL37能夠在轉(zhuǎn)基因水稻中高效表達(dá),且能夠顯著抑制水稻葉枯病的發(fā)生。Chahardoli M[8]等人將重組的牛乳鐵蛋白通過發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入到煙草毛根部,證實(shí)重組牛乳鐵蛋白在發(fā)根中存在,并對(duì)大腸桿菌有良好的抑制作用。Song D[9]等人將兔defensin NP-1基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)入萵苣體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因萵苣能夠?qū)莶菅挎邨U菌和銅綠假單胞菌起到較強(qiáng)抑制作用。另外,在植物中表達(dá)宿主病毒的抗體抑制植物其他病原感染的有效手段之一。Jung Y J[10]等人將多肽Hcap18/LL-37基因融合到花椰菜花葉病毒控制的前導(dǎo)序列,借助花椰菜花葉病毒將Hcap18/LL-37基因轉(zhuǎn)入白菜體內(nèi),成功表達(dá)人類抗菌肽hCAP/LL-37,轉(zhuǎn)基因白菜具有不同程度的抗細(xì)菌及真菌的能力。

Retrocyclin-101(RC101)和Protegrin-1(PG1)是治療細(xì)菌或病毒感染的兩種有效抗菌肽,但其化學(xué)合成價(jià)格昂貴,Lee S B[11]等人創(chuàng)建了Retrocyclin-101(RC101)和Protegrin-1(PG1)基因編碼的葉綠體轉(zhuǎn)化載體,證實(shí)Retrocyclin-101(RC101)穩(wěn)定的整合到煙草葉綠體基因組中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RC101和PG1基因表達(dá)的可溶性蛋白含量分別可達(dá)32%～38%、17%～26%,葉綠體表達(dá)系統(tǒng)獲取的抗菌肽效率比有機(jī)萃取高10倍以上[11]。并且比生物表達(dá)系統(tǒng)和化學(xué)合成便宜且收益率更高,隨著技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為實(shí)驗(yàn)的常用手段之一。

1.3 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 迄今為止,昆蟲是世界上最大的生物種群,超過一半的抗菌肽來自于昆蟲。自20世紀(jì)70年代初,瑞典科學(xué)家Boman等首先從惜古比天蠶中獲得抗菌肽,并確定天蠶素A和B的一級(jí)結(jié)構(gòu)順序,昆蟲免疫進(jìn)入一個(gè)嶄新時(shí)期。昆蟲細(xì)胞是重組桿狀病毒的天然宿主之一,被廣泛用于重組蛋白的表達(dá)及人類和獸醫(yī)生物制品的制備,對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染具有遺傳穩(wěn)定性。桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)在過去的三十多年里已經(jīng)發(fā)展為表達(dá)外源蛋白最廣泛的系統(tǒng)之一。Snakin-1(StSN1)是一種從茄屬植物中提取的一種廣譜性抗菌肽,結(jié)果表明,該抗菌肽在使用細(xì)菌及酵母表達(dá)系統(tǒng)時(shí)均不能有效的解決生產(chǎn)低效的問題。Almasia N I[12]等人將Snakin-1(StSN1)優(yōu)化基因重組到桿狀病毒并感染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞,得到重組Snakin-1多肽,將這些蛋白注射到小鼠體內(nèi),小鼠可以產(chǎn)生抗Snakin-1的抗體。鈣轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)肽在鈣的吸收過程中發(fā)揮重要作用,可以有效的控制細(xì)菌的生理活動(dòng)。Phan T C[13]等人將Caltrin基因插入pcDNA3.1 v5/His-TOPO載體上,隨后將Caltrin-his序列連接到轉(zhuǎn)移載體pBacPAK9中,在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)caltrin(鈣轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)肽),結(jié)果發(fā)現(xiàn),該重組蛋白表達(dá)效率高、特異性好。昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是一種真核表達(dá)系統(tǒng),安全性高,能夠容納較大的外源基因,具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)和高效表達(dá)外源基因的能力。

1.4 動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物體內(nèi)含多種天然抗菌肽,對(duì)多種細(xì)菌有較強(qiáng)殺傷作用。哺乳動(dòng)物是天然的抗菌肽來源庫,大批量誘導(dǎo)合成是實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的一個(gè)有效途徑。試驗(yàn)結(jié)果表明,抗菌肽Cecropin A-magainin在體外有明顯的殺菌作用,為增強(qiáng)其抗菌能力并減少表達(dá)系統(tǒng)的毒副作用,Zhang J[14]等人將該基因通過腺病毒載體轉(zhuǎn)入到小鼠巨噬細(xì)胞中,后期動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示,重組巨噬細(xì)胞能夠明顯抑制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的生長,為控制細(xì)胞內(nèi)感染提供了新方法。陽離子抗菌肽LL-37在腸黏膜防御方面具有重要作用,通常表達(dá)在表面上皮細(xì)胞和人類的淺層結(jié)腸上癮窩,很少表達(dá)在深處的結(jié)腸隱窩或小腸上皮細(xì)胞。Sharma N[15]等人克隆牛的乳鐵蛋白肽基因(Lactoferrin)并轉(zhuǎn)到pIggyBac轉(zhuǎn)座子載體上,在牛乳腺上皮干細(xì)胞中表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),表達(dá)產(chǎn)物在對(duì)抗奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌時(shí)效果顯著。研究表明,pIggy-Bac轉(zhuǎn)座子載體介導(dǎo)的乳鐵蛋白肽在乳腺上皮干細(xì)胞或奶牛乳腺細(xì)胞中的表達(dá)為奶牛乳腺反應(yīng)器奠定了基礎(chǔ)。與其他的真核表達(dá)體系相比,哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的蛋白與天然蛋白的結(jié)構(gòu)、糖基化類型和方式幾乎相同且能正確組裝成多亞基蛋白,但成本較高。

1.5 衣藻表達(dá)載體 單細(xì)胞微生物如大腸桿菌、酵母等,都已用作外源基因表達(dá)載體,然而素有“綠色酵母”之稱的衣藻在蛋白表達(dá)方面卻相對(duì)滯后。Dong B[16]等人將3個(gè)串聯(lián)Mytichitin-A重復(fù)序列基因轉(zhuǎn)移到衣藻體內(nèi),研究顯示,Mytichitin-A可溶性蛋白收益率達(dá)到0.28%且表達(dá)水平持續(xù)六個(gè)月以上,與天然抗菌肽和酵母表達(dá)系統(tǒng)相比,對(duì)革蘭陰性菌的抑制效果更好且無細(xì)胞毒副作用,可以作為細(xì)胞工廠化生產(chǎn)Mytichitin-A。

2 原核表達(dá)載體

原核表達(dá)載體是基因工程中常用的一種,但由于宿主菌的選擇性導(dǎo)致目的蛋白表達(dá)過少或不表達(dá)以及細(xì)胞毒性都限制了原核表達(dá)系統(tǒng)在合成抗菌肽中的使用。常用的抗菌肽原核表達(dá)系統(tǒng)如下：

2.1 大腸桿菌表達(dá) 大腸桿菌是原核表達(dá)最常用的載體之一。殼聚糖酶是一種專門水解殼寡糖的酶,且殼寡糖作為抗菌劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、壞境等領(lǐng)域。為提高殼聚糖酶產(chǎn)量,Kilani-Feki O[17]等人將枯草芽孢桿菌的殼聚糖酶相關(guān)基因(Chitosanase CSNV26 of Bacillus subtilis)通過pBAD載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi),這種蛋白在大腸桿菌內(nèi)分泌量高達(dá)6.2 mg/L,活性研究發(fā)現(xiàn),該蛋白可以引起真菌菌絲的改變甚至形成原生質(zhì)體?？咕腜GLa-AM1具有較強(qiáng)的抗菌活性,但因產(chǎn)量低,難提純等缺陷,限制了其廣泛應(yīng)用。Zhang X[18]等人將PGLa-AM1基因與家蠶蛋白基因融合,再將一個(gè)6×His的標(biāo)簽加到融合蛋白的末端,最后將融合的抗菌肽基因密碼子優(yōu)化克隆到大腸桿菌pET-30a(+)表達(dá)載體中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其表達(dá)量高達(dá)30 mg/L?？咕氖窍忍煨悦庖呋钚晕镔|(zhì),混合不同的抗菌肽在實(shí)際應(yīng)用中具有較好的抗菌效果。WuR[19]等人混合蜂毒肽,將蜂毒肽的疏水性N端與LL37抗菌核心片段連在一起,并將其編碼的DNA序列克隆到pEt-SUMO載體上,最后在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo),Ni-NTA裂解后,上清中SUMO-M-L可溶性蛋白含量約165 mg/L。

大腸桿菌是最早被使用也是研究最透徹的表達(dá)體系,目前仍是很多基因表達(dá)載體的首選。大腸桿菌生長迅速,易于培養(yǎng),能夠大規(guī)模表達(dá)外源基因而且成本較低。但是,其缺乏翻譯后加工修飾功能,表達(dá)產(chǎn)物常以包涵體的形式存在,復(fù)性困難。

2.2 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 枯草芽孢桿菌也稱枯草桿菌,是一類需氧型桿狀革蘭陽性菌。Abaecin是從蜜蜂體內(nèi)得到的一種抗菌肽,它可以提高其他物種抗菌肽對(duì)細(xì)菌的殺傷作用。為了大量提取Abaecin,Li L[20]等將Abaecin基因與煙草蝕紋病毒蛋白酶基因重組,然后將優(yōu)化重組的基因?qū)肟莶菅挎邨U菌,最終成功的獲得抗菌肽Abaecin。Ji S[21]等人將 CAM-W 、EDDIE和信號(hào)肽SacB融合基因轉(zhuǎn)移到由啟動(dòng)子Pg/v控制的pDM03載體中,轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌內(nèi),形成高效表達(dá)的重組枯草芽孢桿菌WB700表達(dá)系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在成功表達(dá)的上清發(fā)酵液中Cecropin A-melittin濃度高達(dá)159 mg/L?？莶菅挎邨U菌WB700表達(dá)系統(tǒng)具有分泌胞外完整生物活性蛋白的功能,而且該系統(tǒng)可以減少分泌蛋白在體外的降解。豬抗菌肽β-defensin-2(pBD-2)和Cecropin P1(CP1)在應(yīng)激和抵御疾病方面發(fā)揮作用,Xu J[22]等人將 β-defensin-2(pBD-2)和 Cecropin P1(CP1)基因融合插入pMK4質(zhì)粒并轉(zhuǎn)移到枯草芽孢桿菌中,生成的枯草芽孢桿菌可以有效的表達(dá)融合抗菌肽,且在體外可以抵抗多種細(xì)菌的活動(dòng)?？莶菅挎邨U菌表達(dá)系統(tǒng)可在短時(shí)間內(nèi)發(fā)酵,同時(shí)表達(dá)幾種蛋白,且能夠避免形成包涵體。

2.3 乳酸鏈球菌表達(dá)系統(tǒng) 乳酸鏈球菌肽也稱乳酸鏈球菌素是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的小分子多肽物質(zhì)。為了提高乳酸桿菌LS01的產(chǎn)量,Ni Z J[23]等人提出將nisRK和nisFEG基因連續(xù)融合成一個(gè)由啟動(dòng)子P32控制的單一穿梭表達(dá)載體pMG36e上,用電穿孔法將重組載體導(dǎo)入細(xì)胞中。瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)乳酸鏈球菌肽的表達(dá)并以16s核糖體RNA為對(duì)照進(jìn)行定量表達(dá)分析,結(jié)果表明,在給定條件下重組表達(dá)的乳酸鏈球菌肽比原始菌株增加50%以上。

2.4 鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng) 鏈霉菌屬于革蘭陽性菌,廣泛用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,常見于土壤及腐敗的植物中。鏈霉菌具有高效分泌胞外蛋白的能力,因此鏈霉菌在表達(dá)蛋白方面更具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。糖肽類抗生素是與D-丙氨酰-D-丙氨酸具有高度親和性的七肽結(jié)構(gòu)抗生素,通過抑制細(xì)胞壁的合成而致使細(xì)菌死亡,幾乎對(duì)所有的革蘭陽性菌均有較好的抗菌活性。為了高效率的表達(dá)糖肽類抗生素,Binda E[24]等人借助pIJ86載體將重組的糖肽類抗生素基因(Glycopeptide antibiotic)轉(zhuǎn)入鏈霉菌屬中表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鏈霉菌獲得了更高的糖肽類抗生素表達(dá)量,而且與抗生素相比最小抑菌濃度較低,可以有效的抑制耐藥菌株的生長。

2.5 干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng) 干酪乳桿菌是公認(rèn)的保健類腸道益生菌,在腸道內(nèi)可長期存在并誘發(fā)機(jī)體的先天性和特異性免疫反應(yīng),研究發(fā)現(xiàn)其具有表達(dá)抗菌肽的潛力。Zhang L[25]等人將合成的基因片段PR39插入pPG：612表達(dá)載體然后轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌393體內(nèi),結(jié)果發(fā)現(xiàn),該干酪乳桿菌不僅對(duì)大腸桿菌和沙門菌有明顯殺菌作用,且對(duì)金黃色葡萄球菌也有輕微的抑制效果。

3 展望

抗菌肽作為最具潛力的抗生素替代藥物之一,由于其商品化產(chǎn)量不能滿足市場(chǎng)需求,利用基因工程方法將有望實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。基因工程技術(shù)表達(dá)的抗菌肽雖然在結(jié)構(gòu)上與天然的抗菌肽有所差異,但是其活性相似,甚至抗菌活性更強(qiáng)。但是各個(gè)系統(tǒng)又有所缺點(diǎn),真核表達(dá)系統(tǒng)雖然能夠高效表達(dá),但產(chǎn)物較復(fù)雜,不易純化且成本較高;原核表達(dá)系統(tǒng)雖然成本低,但缺乏翻譯后的加工修飾,表達(dá)產(chǎn)物大多以包涵體的形式存在。隨著抗菌機(jī)制及基因表達(dá)調(diào)控的不斷深入,相信能夠克服現(xiàn)有系統(tǒng)的種種缺陷,設(shè)計(jì)出更加高效的抗菌肽表達(dá)系統(tǒng),為畜牧業(yè)的發(fā)展和人們的健康提供更好的保障。