單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理及其應(yīng)用

李麗娟，師書王月，張村宇，賀 花，雷初朝，陳 宏，黃永震*

（1.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院畢節(jié)試驗(yàn)區(qū)研究院，貴州畢節(jié)551700；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100）

隨著二、三代測序技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)逐漸被各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如腫瘤基因組計(jì)劃和人類基因組計(jì)劃等。這些測序項(xiàng)目所運(yùn)用的常規(guī)轉(zhuǎn)錄組分析方法需要對數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞的混合樣本進(jìn)行分析，其結(jié)果是大量細(xì)胞測序分析得出的平均值，或者反映的是占數(shù)量優(yōu)勢的細(xì)胞數(shù)據(jù)，但其忽略了單個(gè)細(xì)胞間基因表達(dá)的異質(zhì)性，不利于對細(xì)胞病變過程的追蹤和生物多樣性的研究[1]。同樣對于腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞和早期發(fā)育的胚胎細(xì)胞等這類樣本較少的細(xì)胞來說，常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組分析方法已經(jīng)不能滿足需要[1-2]。而單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序 （single-cell RNA-sequencing，sc RNA-seq） 技術(shù)[3]將分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全轉(zhuǎn)錄組RNA擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測序，從單細(xì)胞水平上獲得全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)譜，對于需要進(jìn)行特異性細(xì)胞研究或者樣本較少的細(xì)胞來說無疑是很好的選擇。同時(shí)，sc RNA-seq技術(shù)可用于不同類型干細(xì)胞的異質(zhì)性分析，例如胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞等[2,4-5]。

1 單細(xì)胞分離技術(shù)

單細(xì)胞測序（Single Cell Sequencing，SCS）的第一步是從微生物培養(yǎng)菌落或者病原微生物所感染的組織中分離出單個(gè)細(xì)胞。常用的單細(xì)胞分離技術(shù)包括微流控法、連續(xù)稀釋法、顯微操作法、熒光激活細(xì)胞分選法和激光捕獲顯微切割法。雖然分離方法眾多，但各有利弊。由于單個(gè)細(xì)胞體積微小，極易被破壞，并對外界環(huán)境極其敏感，且細(xì)胞內(nèi)外的各種組分間含量差異極大，使得分離時(shí)細(xì)胞易因環(huán)境變化而使其內(nèi)外組分發(fā)生改變，同時(shí)在數(shù)量上常常會差出好幾個(gè)數(shù)量級。因此，分離時(shí)難免會對細(xì)胞造成影響或難以分離出單個(gè)細(xì)胞[1]。

1.1 微流控技術(shù)分離單細(xì)胞 微流控技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞主要分為二維（2D）培養(yǎng)和三維（3D）培養(yǎng)2種方式[6]。2D培養(yǎng)即使細(xì)胞在芯片上貼壁生長，通過在芯片上流過培養(yǎng)基來提供營養(yǎng)物質(zhì)，排出廢物，操作簡單易行。3D培養(yǎng)即將細(xì)胞培養(yǎng)在類似于細(xì)胞外基質(zhì)的芯片環(huán)境中，可以盡可能地使細(xì)胞活動趨近于體內(nèi)。微流控技術(shù)可以通過各種細(xì)微結(jié)構(gòu)以及技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞分離，例如微振坑的應(yīng)用。該技術(shù)具有消耗樣品量小、微型化、分析速度快、自動化程度高等顯著優(yōu)勢，強(qiáng)大的集成能力能夠?qū)⒎磻?yīng)、前處理、檢測等流程集成到一個(gè)微流控系統(tǒng)中去完成操作。目前，商業(yè)化的微流控技術(shù)已經(jīng)可以用于單細(xì)胞的全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序[7-8]。

1.2 連續(xù)稀釋法分離單細(xì)胞 連續(xù)稀釋法是將細(xì)胞群體放入合適的細(xì)胞懸液中，不斷進(jìn)行一系列不同梯度倍比稀釋，直至得到極少數(shù)量細(xì)胞甚至是單個(gè)細(xì)胞為止[9-10]。該方法是相對最簡單的一種獲取單細(xì)胞的途徑，不依賴特殊設(shè)備，但不易精確控制得到單個(gè)細(xì)胞，易出錯(cuò)，故而很少應(yīng)用于SCS。

1.3 顯微操作法分離單細(xì)胞 顯微操作法是依賴于人工在高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)與顏色，利用顯微操作器進(jìn)行挑選以分離出單個(gè)細(xì)胞[11]。該方法是在顯微鏡下主觀操作得到單個(gè)細(xì)胞，比起連續(xù)稀釋法更加靈活，能有效控制單個(gè)細(xì)胞的獲取與釋放，但不宜操作大量細(xì)胞，且耗時(shí)較長、難度較大適合只有少量細(xì)胞時(shí)的單細(xì)胞分離，故常用于從早期胚胎或培養(yǎng)的微生物中提取單個(gè)細(xì)胞[12]。

1.4 熒光激活細(xì)胞分選法分離單細(xì)胞 熒光激活細(xì)胞分選法（Fluorescence-activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS）[13]是基于預(yù)先用熒光標(biāo)記的細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)志或細(xì)胞光散射的特性，通過流式細(xì)胞儀分選出單個(gè)細(xì)胞或某些特殊細(xì)胞群的技術(shù)。此技術(shù)具有全自動、高精度和高通量優(yōu)勢，能夠特異性地分選細(xì)胞，是目前比較經(jīng)濟(jì)且有效的方法。

1.5 激光捕獲顯微切割法分離單細(xì)胞 激光捕獲顯微切割法（Laser Capture Microdissection，LCM）是選擇性地利用激光在顯微鏡下從固定組織切片中進(jìn)行顯微切割和分離單細(xì)胞。此技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地獲取單一細(xì)胞或細(xì)胞亞群，有效地解決了細(xì)胞異質(zhì)性的問題，可廣泛應(yīng)用于癌癥單細(xì)胞的分離與研究[14]。

2 sc RNA-seq技術(shù)

SCS是在單個(gè)細(xì)胞水平上對包括基因組、轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）和表觀遺傳組在內(nèi)的組學(xué)測序技術(shù)。其中，轉(zhuǎn)錄組廣義上是指在某一特定生理?xiàng)l件下，一個(gè)細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，包括編碼RNA（rRNA、tRNA、mRNA）和非編碼RNA；狹義上特指細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA的總和[15]。與基因組不同的是，轉(zhuǎn)錄組的研究有著時(shí)間和空間上的限制，即同一細(xì)胞在不同的生長階段和環(huán)境下，其基因的表達(dá)情況是有所差別的。sc RNA-seq首先是構(gòu)建cDNA文庫，然后進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組cDNA的擴(kuò)增和測序，其中轉(zhuǎn)錄組的擴(kuò)增是該技術(shù)的關(guān)鍵步驟[1]。

據(jù)估計(jì)，在單細(xì)胞中總RNA或mRNA的量分別約為10 pg或0.1 pg[16]。因此，全轉(zhuǎn)錄組測序（Whole Transcriptome Sequencing，WTA）是用于構(gòu)建sc RNA-seq的cDNA文庫的必要步驟。在新一代測序技術(shù)（Nextgeneration Sequencing，NGS）出現(xiàn)之前，WTA已被用于擴(kuò)增單細(xì)胞的RNA以獲得微陣列中的基因表達(dá)譜[17-18]。Tang等[3]改進(jìn)了單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增方法，并使用NGS代替微陣列在單細(xì)胞中鑒定更多基因和以前未知的剪接點(diǎn)。這一研究標(biāo)志著sc RNA-seq的成熟。該方法的原理是使用寡脫氧胸腺苷酸（oligo dT）引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并通過PCR選擇性擴(kuò)增聚腺苷酸化mRNA。另一種WTA方法，即SMART-seq，被用于使用莫洛尼鼠類白血病病毒（Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶來構(gòu)建全長cDNA文庫[19]。

SMART-seq的優(yōu)勢在于從單細(xì)胞RNA中產(chǎn)生并擴(kuò)增全長cDNA，從而檢測出可變剪接的外顯子[20]。SMART的低靈敏度是SMART-seq2[21]的主要缺點(diǎn)。改良的SMART-seq2可以對數(shù)百個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組同時(shí)進(jìn)行測序，不依賴特殊的單細(xì)胞捕獲工具或者試劑盒。同樣，單細(xì)胞反向標(biāo)記技術(shù)是基于逆轉(zhuǎn)錄酶的模板轉(zhuǎn)換特性來標(biāo)記cDNA的5'端[22]。這種方法使研究人員能夠比較多個(gè)樣本中的基因表達(dá)譜差異而沒有偏差，但是它會產(chǎn)生強(qiáng)烈的5'端偏差。通過線性放大細(xì)胞表達(dá)法（Cel-seq）用條形碼標(biāo)記cDNA并從多重單細(xì)胞收集這些cDNA用于體外轉(zhuǎn)錄來線性擴(kuò)增cDNA[23]。與基于PCR的擴(kuò)增方法相比，Cel-seq的結(jié)果更加靈敏，具有線性特征，但它易產(chǎn)生3'端偏差。

獨(dú)特的分子標(biāo)識符（UMIs）標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于單細(xì)胞WTA中來實(shí)現(xiàn)定量單細(xì)胞RNA測序[24]。該方法通過消除擴(kuò)增偏差，明顯提高了單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組測序的準(zhǔn)確性。最近，2種新的基于液滴的RNA-seq技術(shù)，被稱為Drop-seq[25]和inDrop[26]，已被用于從組織中并行測序數(shù)千個(gè)單細(xì)胞。每個(gè)納米級的水溶液都是一個(gè)微小的反應(yīng)室，其中包含單個(gè)細(xì)胞、DNA啟動子條形碼和UMI標(biāo)記的引物以及緩沖液。它在溶解細(xì)胞后，經(jīng)轉(zhuǎn)錄，mRNA被條形碼標(biāo)記，以此可以追蹤每個(gè)基因在細(xì)胞中的來源，極大地提高了測序通量。在實(shí)驗(yàn)過程中，于Drop-seq中對附著在微粒上的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而對inDrop使用Cell-seq進(jìn)行測序。這些方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠區(qū)分每個(gè)mRNA的原始細(xì)胞，這有助于在復(fù)雜的組織中進(jìn)行單細(xì)胞分析。

此外，傳統(tǒng)的PCR技術(shù)對溫度等條件要求較高，且擴(kuò)增的片段較短，變異系數(shù)較高，容易造成非特異性擴(kuò)增。而多重置換擴(kuò)增技術(shù)利用phi29DNA聚合酶以及6個(gè)隨機(jī)堿基的寡核苷酸引物，在30℃條件下進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，不需要進(jìn)行高溫處理。反應(yīng)開始時(shí)，6個(gè)寡核苷酸引物先分別與模板鏈的不同部位結(jié)合，之后在phi29DNA聚合酶的作用下開始在不同位點(diǎn)同時(shí)復(fù)制延伸獲得產(chǎn)物并代替原來模板的互補(bǔ)鏈，而原來模板的互補(bǔ)鏈則會成為新的模板鏈繼續(xù)進(jìn)行下一輪反應(yīng)。因?yàn)橐锱c模板鏈結(jié)合較緊密，所以該反應(yīng)可獲得高分子量的DNA產(chǎn)物，最高可達(dá)100 kb，避免了因高溫而導(dǎo)致DNA降解對產(chǎn)物的影響和因GC含量不同而引發(fā)的優(yōu)勢擴(kuò)增。但由于該技術(shù)擴(kuò)增均勻度不高，故可用于單核苷酸多態(tài)性及其突變的相關(guān)研究[1,27]。

3 高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)（High-throughput RNA Sequencing）有第2代測序技術(shù)（454 焦磷酸測序、Solexa聚合酶合成測序和SOLiD連接酶測序）和第3代測序技術(shù)（單分子納米孔測序技術(shù)和單分子實(shí)時(shí)測序技術(shù)等）[28]。第2代測序技術(shù)基于“邊合成邊測序”，利用高通量測序技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，對測序得到的大量原始讀長（Reads）進(jìn)行過濾、組裝及生物信息學(xué)分析出不同RNA的表達(dá)量，因此能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，識別可變剪切位點(diǎn)和單核苷酸多態(tài)性。第2代測序技術(shù)因其高通量、高效率和低成本的優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究和藥物研發(fā)等領(lǐng)域[29]。第3代測序技術(shù)是基于單分子水平上的“邊合成邊測序”，不依賴PCR擴(kuò)增，降低了系統(tǒng)誤差，同時(shí)還能檢測特定序列的SNP，測定出稀有突變及其發(fā)生頻率。相對于第2代測序技術(shù)來說，第3代測序技術(shù)的原始讀長較長，因而不易受GC含量影響，能夠直接對RNA測序。

將上述高通量測序技術(shù)應(yīng)用到RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA的測序分析中，就產(chǎn)生了RNA-seq技術(shù)。與其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相比，高通量測序技術(shù)的相對優(yōu)勢就更加明了：能夠用較少的樣本在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行高通量、低成本、高度可重復(fù)性的測序；基因表達(dá)定量的范圍較廣，可用于基因轉(zhuǎn)錄水平的研究；可獲得未知轉(zhuǎn)錄本，對低豐度表達(dá)的基因檢測更加準(zhǔn)確[28]。

4 sc RNA-seq的應(yīng)用

4.1 在腫瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用 癌癥的異質(zhì)性來自于克隆的多樣性和突變的進(jìn)化，它促進(jìn)了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并發(fā)現(xiàn)了癌癥的診斷和治療[30]。SCS作為一種理想的工具已被越來越多地應(yīng)用于揭示各種原發(fā)腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性，如乳腺癌、肺癌[31]、結(jié)腸癌等。

Eirew等[32]研究了乳腺癌患者的基因組克隆在單個(gè)細(xì)胞的分辨率下的動力學(xué)，該研究表明基因組畸變可能是進(jìn)化軌跡的可重復(fù)決定因素。有趣的是，單細(xì)胞全基因組測序研究結(jié)腸癌時(shí)發(fā)現(xiàn)了大量在個(gè)體水平上的突變基因SLC12A5，并且發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌具有雙源性[33]，但隨后發(fā)展為2個(gè)不同的腫瘤細(xì)胞亞群。然而，另一項(xiàng)利用單個(gè)細(xì)胞外顯子序列的研究揭示了膀胱癌的演變過程，它表明66個(gè)個(gè)體膀胱癌細(xì)胞是由單個(gè)的細(xì)胞分裂而成，但是隨后發(fā)展成2個(gè)不同的腫瘤細(xì)胞亞群[34]。Hughes等[35]從3種骨髓增生異常綜合征（MDS）中提取出單個(gè)細(xì)胞，從大量樣品分析中確定了克隆結(jié)構(gòu)。單細(xì)胞外顯基因測序揭示了在JAK2陰性骨髓增力腫瘤中發(fā)生的單克隆進(jìn)化，并進(jìn)一步確定了腫瘤的候選基因突變。

近些年，一系列研究使用SCS來了解不同的罕見循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）。CTCs是從腫瘤原發(fā)灶中脫落而進(jìn)入患者外周血中的一種癌細(xì)胞，數(shù)量稀少，但與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有著密切的關(guān)聯(lián)，已經(jīng)有很多平臺用于檢測和充實(shí)CTCs[1]。例如，Ramsk?ld等[36]通過SMART-seq對單個(gè)循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞分析找到了多個(gè)基因的不同表達(dá)，并在前列腺淋巴結(jié)癌細(xì)胞中檢測出了大多數(shù)的活躍基因，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了不同的基因表達(dá)模式。計(jì)數(shù)CTCs已經(jīng)被用作預(yù)測癌癥患者存活率的預(yù)后指標(biāo)。然而，CTCs應(yīng)該具有更大的潛力。對單細(xì)胞水平的CTCs的研究可能有助于揭示腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制。這一領(lǐng)域雖然遠(yuǎn)未發(fā)展，但在提供新的臨床應(yīng)用和深入了解腫瘤轉(zhuǎn)移和癌癥發(fā)展方面仍有很大的潛力。

4.2 在眼科研究領(lǐng)域的應(yīng)用 視網(wǎng)膜具有一定的神經(jīng)元多樣性，能夠用于研究神經(jīng)元分化和神經(jīng)系統(tǒng)多樣性。視網(wǎng)膜由神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、光感受器細(xì)胞等多種類型細(xì)胞組成，由于其復(fù)雜的組成結(jié)構(gòu)，常規(guī)的基因測序已不能準(zhǔn)確反映細(xì)胞間的特異性，而sc RNA-seq卻能夠克服這一困難，精確地反映出單個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞的基因表達(dá)情況。Goetz等[37]闡述了對于單個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析的實(shí)驗(yàn)步驟。Shekhar等[38]用GSP轉(zhuǎn)染雙極細(xì)胞和 Müller 膠質(zhì)細(xì)胞，通過FACS 收集 GFP 陽性細(xì)胞，并應(yīng)用大規(guī)模Drop-seq將約25 000個(gè)小鼠視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞分類，獲得了15個(gè)雙極細(xì)胞亞型；同時(shí)利用分子表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)相匹配的方法驗(yàn)證了這種分類方法的準(zhǔn)確性，并鑒定了多種新的遺傳標(biāo)記物。鑒定單個(gè)視網(wǎng)膜細(xì)胞亞型遺傳標(biāo)記物有利于研究與特定視功能相關(guān)的靶點(diǎn)，使人們能夠更深入地了解細(xì)胞功能和細(xì)胞異質(zhì)性的來源。

視網(wǎng)膜退行性病變，如年齡相關(guān)性黃斑變性（Agerelated Macular Degeneration，AMD） 是光感受器細(xì)胞發(fā)生損傷的結(jié)果，這也是發(fā)達(dá)國家人群視力退化的主要原因。Radeke團(tuán)隊(duì)將68例眼組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，其中有31例正常，26例已經(jīng)確診為AMD，11例被認(rèn)為是極有可能發(fā)展為AMD。研究發(fā)現(xiàn)，在干性AMD患者中與凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)度高；在濕性AMD患者中與血管生成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)度高；所有類型的AMD都是有細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，AMD可能是具有共同的免疫反應(yīng)的單一性疾病[11]。

4.3 在免疫學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用 免疫系統(tǒng)的異質(zhì)性有助于抵御多種不同病原體的有效防御。近年來，sc RNA-seq開始被應(yīng)用于免疫系統(tǒng)的研究當(dāng)中。免疫細(xì)胞對抗原物質(zhì)的應(yīng)答反應(yīng)的特點(diǎn)是具有復(fù)雜和不均一的異質(zhì)性。脂多糖能夠激活樹突狀細(xì)胞的ToⅡ樣受體從而引發(fā)轉(zhuǎn)錄組的改變。Mahata等[39]使用sc RNA-seq來揭示T helper 2（Th2）細(xì)胞群內(nèi)的廣泛異質(zhì)性，并鑒定出一種新的Th2細(xì)胞亞群，其標(biāo)記有調(diào)控類固醇合成途徑的Cyp11a1。Shalek等[40]利用RNA轉(zhuǎn)錄5′末端的技術(shù)，對來源于小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞（Bone-marrowderived dendritic Cells，BMDCs）構(gòu)建了 cDNA 文庫及其測序分析，結(jié)果顯示，在單細(xì)胞水平上，樹突狀細(xì)胞的反應(yīng)呈高度異質(zhì)性。在部分樹突狀細(xì)胞中許多已知的調(diào)控炎癥反應(yīng)的基因一直處于完全被激活狀態(tài)，而在其他細(xì)胞中僅處于被低度激活或未被激活，并且這種反應(yīng)應(yīng)答的異質(zhì)性與樹突狀細(xì)胞的成熟狀態(tài)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的隨機(jī)性有關(guān)[1]。

盡管目前SCS研究免疫系統(tǒng)的應(yīng)用比較有限，但SCS已經(jīng)顯示出了對免疫細(xì)胞子群的強(qiáng)大潛力以及檢測基因表達(dá)變異性、差異拼接和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的潛力。

4.4 在動物育種研究領(lǐng)域的應(yīng)用 在幼畜體外胚胎生產(chǎn)和移植技術(shù)（Juvenile in vitro Embryo Transfer，JIVET）中，利用sc RNA-seq篩選出影響羔羊卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵基因，并結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對基因進(jìn)行定量驗(yàn)證，即從分子水平研究卵母細(xì)胞成熟的調(diào)控機(jī)制，以此來提高羔羊卵母細(xì)胞發(fā)育后期胚胎的潛力，并成功發(fā)現(xiàn) MOS、RPS6KA1、CPEB1、ANAPC13和 CDK1 5個(gè)基因?qū)Ω嵫蚵涯讣?xì)胞的成熟有極其重要的作用[41]。JIVET以幼齡母畜卵巢上卵母細(xì)胞為卵源在體外培養(yǎng)胚胎，有利于縮短家畜繁殖的世代間隔，充分發(fā)掘出具有優(yōu)良遺傳性狀的母畜的繁殖潛能，同時(shí)提高了家畜的遺傳改良速度與生產(chǎn)效率，為家畜育種提供了豐富的遺傳資源。

Di等[42]對發(fā)情期的灘羊和小尾寒羊卵巢的miRNA通過高通量測序技術(shù)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在183個(gè)不同miRNA家族中的483條miRNA，在乏情期中有25條表達(dá)情況差異顯著，對發(fā)情期的調(diào)控起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，通過分析比較轉(zhuǎn)錄組，對于下丘腦-垂體-卵巢性腺軸調(diào)控的排卵及卵泡發(fā)育方面神經(jīng)活性的配體-受體相互作用信號通路起著重要的調(diào)控作用，且篩選出影響產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)基因，豐富和補(bǔ)充了綿羊基因組的信息[43]。

蘭道亮等[44]通過RNA-seq技術(shù)對牦牛GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序和數(shù)據(jù)對比分析，篩選出了4 767個(gè)差異表達(dá)基因；對差異基因經(jīng)KEGG通路互作分析后發(fā)現(xiàn)，在牦牛卵母細(xì)胞成熟過程中代謝通路對基因上調(diào)和下調(diào)通路均起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。該團(tuán)隊(duì)在另外一項(xiàng)研究中通過RNA-seq技術(shù)對牦牛和中原黃牛發(fā)情期卵巢的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序和對比分析發(fā)現(xiàn)[45]，細(xì)胞粘附過程是區(qū)別黃牛和牦牛卵巢生理活動的重要條件之一；補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路與牦牛的繁殖和卵巢發(fā)育之間關(guān)系密切，這可能與牦牛所處的特殊的自然環(huán)境有關(guān)。蘭道亮等[44]對牦牛MⅡ卵母細(xì)胞和發(fā)情期卵巢分別進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測序研究進(jìn)一步解釋了兩者的分子作用機(jī)制，為了解牦牛的繁殖特異性提供了新的理論基礎(chǔ)。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，單細(xì)胞體積微小，極易被破壞，對外界環(huán)境敏感，且細(xì)胞內(nèi)外組分不穩(wěn)定，雖分離時(shí)難度大，但多種單細(xì)胞分離技術(shù)能夠滿足不同類型細(xì)胞的分離與提取，在最大程度上得到理想狀態(tài)的單細(xì)胞；sc RNA-seq通過從單個(gè)細(xì)胞水平上獲得全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)譜，可以深入分析不同單個(gè)細(xì)胞之間的異質(zhì)性、基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)等；高通量、高效率和低成本的高通量測序技術(shù)可以直接對RNA測序，能夠發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，可以直接對RNA測序，且結(jié)果更加準(zhǔn)確。基于這一綜合優(yōu)勢，sc RNA-seq的應(yīng)用領(lǐng)域從哺乳動物早期胚胎發(fā)育逐漸擴(kuò)大到現(xiàn)在的免疫學(xué)、眼科、腫瘤等人類疾病方面，并獲得良好效果。

要使sc RNA-seq在未來的應(yīng)用范圍更加廣泛，發(fā)揮出更大的應(yīng)用價(jià)值，一方面，應(yīng)對該技術(shù)進(jìn)行更深一步的研究，解決當(dāng)前存在的諸多問題，使該項(xiàng)技術(shù)更加完善，尤其是單細(xì)胞分離技術(shù)，如何更加高效、優(yōu)質(zhì)、快速地獲取單細(xì)胞，同時(shí)，測序技術(shù)也需要向高通量、準(zhǔn)確、廉價(jià)等方向進(jìn)一步完善。另一方面，如何將sc RNA-seq與其他技術(shù)完美結(jié)合并應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)操作和疾病治療將會是今后相關(guān)研究的重要方向。如，轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白組學(xué)的聯(lián)合分析在有關(guān)綿羊發(fā)情的主效基因研究中起著至關(guān)重要的作用，但兩者之間通過相互作用來調(diào)控生理活動的作用機(jī)制仍是目前研究的熱點(diǎn)問題；sc RNA-seq與細(xì)胞成像技術(shù)的結(jié)合可為揭示基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)引起細(xì)胞差異以及進(jìn)行動態(tài)調(diào)控的作用機(jī)制提供檢測方法。實(shí)時(shí)和體內(nèi)對單個(gè)細(xì)胞的DNA和RNA進(jìn)行測序和分析將成為一個(gè)新的領(lǐng)域，它可以深入了解單個(gè)細(xì)胞的分子結(jié)構(gòu)在空間和時(shí)間上的測量。另外，基于sc RNA-seq已有的應(yīng)用，該技術(shù)自身還存在待改進(jìn)的地方：龐大的樣本量使得數(shù)據(jù)分析更為復(fù)雜；應(yīng)該向高通量、自動化方向更進(jìn)一步發(fā)展，不僅僅對單個(gè)細(xì)胞或樣品分析，而且能夠完成集成化和規(guī)?；姆治觯麄€(gè)實(shí)驗(yàn)過程的自動化操作，使用專業(yè)商業(yè)試劑盒，更大程度上提高效率，降低成本；細(xì)胞之間轉(zhuǎn)錄組的差別較大，對于不同豐度的轉(zhuǎn)錄組在放大時(shí)仍有線性擴(kuò)增現(xiàn)象，使一些低拷貝的基因在此過程存在丟失的可能，從而引起分析結(jié)果的偏差，因此，改善放大轉(zhuǎn)錄組的方法，盡可能防止基因的丟失，使分析結(jié)果更為精準(zhǔn)也是有待解決的一個(gè)問題?？傊?，隨著科研人員的大量實(shí)驗(yàn)與研究，sc RNA-seq技術(shù)不斷發(fā)展，以及各環(huán)節(jié)技術(shù)日益成熟，許多相關(guān)病理生理的調(diào)控機(jī)制會被逐漸闡明，在動物育種、疾病的治療及藥物研發(fā)等領(lǐng)域?qū)懈迂S碩的成果，對人類戰(zhàn)勝疾病和豐富家畜育種的遺傳資源有著重大意義。