通腑泄?jié)岱▽?duì)CKD模型大鼠腎功能及腸道屏障功能的影響

鐘　丹，黃宇清，蕭建華，王　霞，肖鳳儀

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通腑泄?jié)岱▽?duì)CKD模型大鼠腎功能及腸道屏障功能的影響

*鐘丹，黃宇清，蕭建華，王霞，肖鳳儀

（井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江西，吉安 343000 ）

探討通腑泄?jié)岱▽?duì)慢性腎臟?。–KD）模型大鼠腸道屏障功能的影響，初步探討其延緩CKD進(jìn)展的機(jī)理。應(yīng)用5/6腎切除法構(gòu)建CKD大鼠模型，SD雄性大鼠120只隨機(jī)分為空白組，模型組，通腑泄?jié)峤M（高、中、低劑量），藥用炭組，每組20只，從模型建立后開(kāi)始灌腸，療程4周，第4周末檢測(cè)血清肌酐，血硫酸吲哚酚水平，觀察腎組織病理結(jié)構(gòu)變化。CKD模型組大鼠腎組織可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞變性、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生等病理變化，通腑泄?jié)峤M與CKD模型組大鼠相比較均有不同程度的改善，其中以通腑泄?jié)岣邉┝拷M改善最為明顯。通腑泄?jié)岣鲃┝拷M和藥用炭組血內(nèi)毒素、D-乳酸含量明顯下降(＜0.05)，且高劑量組比藥用炭組下降更為明顯(＜0.05)。通腑泄?jié)岱ň哂幸欢ǖ谋Ｗo(hù)腎臟和抗腎間質(zhì)纖維化的作用，降低大鼠血內(nèi)毒素、D-乳酸含量，保護(hù)腸粘膜屏障功能可能是其機(jī)制之一。

中藥灌腸；腸粘膜屏障；慢性腎臟病

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）包括了慢性腎小球腎炎、腎小管間質(zhì)病變等原發(fā)性腎損害及高血壓、糖尿病等繼發(fā)性腎臟損害，具有隱匿性、治療難度大、病情復(fù)雜多變等特征，因此需要中西醫(yī)結(jié)合治療，才能從根本上減少慢性腎臟疾病的發(fā)病率，延緩腎功能衰退的進(jìn)展。腸道在多種尿毒癥毒素的代謝過(guò)程中都起著重要作用[1]。腸粘膜屏障是機(jī)體與外界之間的主要屏障，既可以阻止外界有害物質(zhì)的入侵，又可以防止體內(nèi)物質(zhì)的流失。CKD的患者腸腔內(nèi)堆積大量代謝廢物，腸道微生態(tài)及腸道粘膜屏障功能發(fā)生顯著改變，內(nèi)毒素、D-乳酸、硫酸吲哚酚等腸源性毒素的大量產(chǎn)生，最終導(dǎo)致CKD進(jìn)一步加重[2]。因此，以腸道作為靶點(diǎn)，清除腸源性毒素等，逐漸成為國(guó)內(nèi)外控制慢性腎衰進(jìn)展的重要方法和手段。本課題組研究中采用通腑泄?jié)犷愔兴帍?fù)方灌腸治療，觀察通腑泄?jié)岱▽?duì)CKD大鼠腸道屏障功能的保護(hù)作用，探討其延緩CKD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

通腑泄?jié)岱剑狐S芪20 g、大黃30 g、牡蠣30 g、蒲公英30 g，以上藥材由井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，由井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理教研室經(jīng)煎煮、過(guò)濾、水浴蒸發(fā)分別濃縮至每毫升含生藥材1、2、3 g，即低、中、高3個(gè)劑量，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫凰幱锰计?gòu)自河北長(zhǎng)天藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13022797。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康SD雄性大鼠（體質(zhì)量200 ± 10 g），清潔級(jí)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：0003467。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為：空白組，模型組，藥用炭組，通腑泄?jié)岬蛣┝拷M，通腑泄?jié)嶂袆┝拷M，通腑泄?jié)岣邉┝拷M，每組20只，自由飲水、進(jìn)食。

1.3 造模及給藥方法

采用5/6腎切除造模方法[3]，使用10%水合氯醛0.3 mL/100 g（體重）進(jìn)行腹腔麻醉后，從距左肋骨下緣、脊柱旁開(kāi)2處皮膚做一縱向切口，暴露左側(cè)腎臟，用止血鉗和手剝離腎周脂肪和包膜，使用動(dòng)脈夾夾閉左側(cè)腎蒂，眼科小手術(shù)剪切除左腎上、下極外側(cè)共2/3腎實(shí)質(zhì)，明膠海棉壓迫創(chuàng)面止血，小心將殘腎還納入腹腔，逐層縫合肌層、皮下及皮膚，局部消毒。一周后摘除右腎，結(jié)扎右腎血管，麻醉及手術(shù)過(guò)程相同，即可制備成5/6腎切除大鼠模型。假手術(shù)模型即分別同時(shí)進(jìn)行開(kāi)腹后暴露雙側(cè)腎臟后，還納腎臟后，縫合肌肉、皮下及皮膚，其他步驟同上。各組均于模型建立后進(jìn)行灌腸，通腑泄?jié)岱焦嗄c量分別按3、2、1 g/(kg.d)灌腸給藥。模型組以等量生理鹽水灌腸。藥用炭組灌腸量為1.5 g/(kg.d)。灌腸量均為5 mL/次，每日1次。

2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.1 血肌酐測(cè)定

采用日立7170A型全自動(dòng)生化測(cè)定儀測(cè)定。

2.2 內(nèi)毒素、D-乳酸測(cè)定

采用改良的酶學(xué)分光光度法進(jìn)行。試劑盒購(gòu)自上海豐壽生物科技有限公司，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

2.3 病理檢測(cè)

留取腎臟組織，以10%中性甲醛固定后，脫水、浸蠟、石蠟包埋，切成4 μm厚度石蠟切片，分別行HE 染色及Masson 染色，光鏡下觀察腎小管間質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（`X ± S），采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用單因素方差分析，方差不齊者改用秩和檢驗(yàn)的Kruskal－Wallish方法進(jìn)行多個(gè)樣本比較及兩兩比較。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)模型大鼠腎臟組織病理形態(tài)的影響

HE、Masson 染色觀察：CKD模型組出現(xiàn)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，伴有小管上皮細(xì)胞顆粒、空泡變性，部分腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，可見(jiàn)腎小管灶狀萎縮；藥用炭組、通腑泄?jié)峤M病理變化較CKD模型組有一定程度的減輕，而通腑泄?jié)岣邉┝拷M減輕最為明顯（見(jiàn)圖1、2、3、4）。

圖1 模型組HE染色×200

圖2 模型組Masson染色×200

圖3 通腑泄?jié)岣邉┝拷MHE染色×200

圖4 通腑泄?jié)岣邉┝拷MMasson染色×200

3.2 對(duì)模型大鼠血肌酐、內(nèi)毒素、D-乳酸的影響

與空白組比較，各組大鼠血肌酐、血尿素氮、內(nèi)毒素、D-乳酸水平均明顯上升，模型組升高尤其明顯（< 0.01），反映模型構(gòu)建成功。與模型組相比較，通腑泄?jié)岣鲃┝拷M及藥用炭組血肌酐水平在上述指標(biāo)上均有不同程度的降低，其中以通腑泄?jié)岣邉┝拷M降低尤為明顯（< 0.05）（見(jiàn)表1）。

表1各組大鼠血肌酐、內(nèi)毒素、D-乳酸值比較（`X±S）

Table1 Cmparing the level of the serum creatinine、endotoxin and D-lactic acid values in rats of each group

注：與空白組比較：*<0.05，**<0.01；與模型組比較：△< 0.05，△△< 0.01

4 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為CKD病理機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，表現(xiàn)為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證，主要以脾腎虧虛貫穿疾病始末；因脾腎虧虛致腎失開(kāi)闔、脾失運(yùn)化而使?jié)駶帷⑺畾?、血瘀等濁毒?nèi)蘊(yùn)，從而加重疾病。濁毒在慢性腎衰疾病發(fā)展中既是病理產(chǎn)物，又是致病因素，其性纏綿，為病情遷延不愈之關(guān)鍵，因此健脾益腎、通腑泄?jié)岱ㄊ桥R床治療的重要治法[4-5]。

唐代孫思邈在《備急千金要方》中指出：“欲療諸病，當(dāng)先以湯蕩滌五臟六府，開(kāi)通諸脈，治道陰陽(yáng)，破散邪氣，潤(rùn)澤枯朽，悅?cè)似つw，益人氣血”, 很好地詮釋了通下法在中醫(yī)治則中的重要性。中藥灌腸改變了傳統(tǒng)的給藥途徑，通過(guò)將藥物直接作用于腸道內(nèi)，再經(jīng)血液循環(huán)，使藥效到達(dá)靶器官，進(jìn)而發(fā)揮治療效果。此外，腸道給藥既能對(duì)腸道中的有害菌群進(jìn)行抑制，減少腸道中蛋白分解，又能使腸道黏膜血管通透性增加，促進(jìn)腸蠕動(dòng)，促使腸道將體內(nèi)毒素排出體外，進(jìn)而抑制尿毒癥毒素，避免腎臟受到進(jìn)一步損害[6-8]。

通腑泄?jié)峁嗄c方在我院臨床使用多年，對(duì)于CKD3~4期之前的患者療效顯著，對(duì)于慢性腎衰患者的臨床癥狀及腎功能均有改善作用。灌腸方由黃芪20 g、大黃30 g、蒲公英30 g、牡蠣30 g組成。方中黃芪補(bǔ)益脾腎，大黃通腑瀉濁祛濕，蒲公英解毒而利濕濁，牡蠣滋陰潛陽(yáng)?，F(xiàn)代藥理研究也顯示：大黃具有瀉下作用，能促進(jìn)腸道毒素的排泄，抑制腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化，延緩慢性腎衰進(jìn)程；蒲公英抗菌消炎，降低腸道毒素，抑制腸道細(xì)菌的繁殖；牡蠣能防止大黃瀉下之力太過(guò)，又可增加灌腸液的滲透壓，有助于周圍組織向腸道內(nèi)分泌毒素。在本研究中也觀察到，隨著中藥灌腸方劑量的加大，CKD模型大鼠的血肌酐、血尿素氮以及反映腸粘膜屏障功能的兩個(gè)重要指標(biāo)——內(nèi)毒素和D-乳酸的含量均有一定程度的下降。腎臟組織病理觀察也發(fā)現(xiàn)灌腸方可以減輕模型大鼠腎組織的病理?yè)p害。

本研究結(jié)果表明：通腑泄?jié)嶂兴帍?fù)方灌腸治療可以在一定程度上改善模型大鼠腎小管間質(zhì)的微觀病理?yè)p害，降低血肌酐、內(nèi)毒素和D-乳酸的含量，對(duì)CKD大鼠腸粘膜屏障具有一定的保護(hù)作用，可能是其延緩CKD進(jìn)展的機(jī)制之一。

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EFFECT OF THE METHOD "TONG FU XIE ZHUO" ON RENAL FUNCTION AND INTESTINAL BARRIER FUNCTION IN CKD MODEL RATS

*ZHONG Dan, HUANG Yu-qing, XIAO Jian-hua, WANG Xia, XIAO Feng-yi

（Department of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000, China)

To investigate the effect of the method of "Tong Fu Xie Zhuo" on the intestinal barrier function in rats with chronic kidney disease (CKD), and explore the mechanism of delaying the progress of CKD.The rat model of CKD was established by 5 / 6 nephrectomy. 120 SD male rats were randomly divided into blank group, model group, high, middle and low dosage group (high, middle and low dosage) and medicinal charcoal group (20 rats in each group). The rats were given with enema for 4 weeks. Serum creatinine was detected at the end of the 4th week.Renal tubular epithelial cell degeneration was observed in CKD model group. The pathological changes, such as interstitial inflammatory cell infiltration, fibrous tissue proliferation and so on, were improved in different degrees in the group of purge turbidity of the Fu organs compared with the rats in the CKD model group, especially in the group of high dosage of purging turbidity of the Fu organs. The contents of endotoxin and D-lactic acid in blood of each dosage group and medical charcoal group were significantly decreased (< 0.05). The high dose group was significantly lower than that of the medicinal carbon group (< 0.05).Tthe method of "Tong Fu Xie Zhuo" can protect kidney and prevent renal interstitial fibrosis, and decrease the contents of endotoxin and D-lactic acid in blood of rats. Protection of intestinal mucosal barrier function may be one of its mechanisms.

traditional Chinese medicine enema; intestinal mucosal barrier; CKD

R256.51

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.06.018

2018-09-02；

2018-10-22

江西省科技廳社發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(20151BBG701453)

*鐘 丹(1974-)，男，江西于都人，副教授，博士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治腎臟疾病的研究(E-mail:zd93139@163.com);

黃宇清(1978-)，女，江西泰和人，副教授，碩士，主要從事腎臟疾病防治的研究(E-mail:C7832@163.com);

蕭建華(1978-)，女，江西吉安人，講師，主要從事小兒腎臟疾病防治的研究(E-mail:zhhpxjh@126.com);

王 霞(1979-)，女，江西吉安人，講師，主要從事臨床病理檢測(cè)研究(E-mail:18815828@qq.com);

肖鳳儀(1981-)，女，江西吉安人，講師，碩士，主要從事中醫(yī)藥防治免疫性疾病的研究(E-mail:xiaofengyi2003@163.com).

1674-8085(2018)06-0092-04