陽離子型納米載體在遞送抗腫瘤藥物過程中的細胞轉(zhuǎn)運機制及影響因素的研究概況Δ

何麗雅，紀優(yōu)，周岳茜，盧詩佳，丁寶月，張潔（嘉興學院醫(yī)學院，浙江嘉興314001）

目前，化學藥物治療是臨床上治療腫瘤的常用方法，但缺乏靶向性的化學藥物會給患者造成嚴重的毒副作用[1]。采用納米載體包裹化學藥物可以降低其毒副作用，根據(jù)納米載體表面所帶電荷的不同，分為陽離子型納米載體、中性納米載體和陰離子型納米載體；與其他兩種納米載體相比，陽離子型納米載體除了可以包載化學藥物，還具有靶向性可以攜帶基因藥物進入腫瘤細胞，在化學藥物治療和基因藥物治療上具有重要地位[2-4]。

目前，已報道的陽離子型納米載體有陽性脂質(zhì)體、陽離子型樹狀大分子、金屬納米顆粒、聚合物膠束等[5]。這些陽離子型納米載體在生理條件下帶正電，可以與帶負電的基因藥物結(jié)合，保護基因藥物不被核酸酶降解，是目前最常用的非病毒基因藥物載體[2-3，6-8]。已上市的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine即是陽性脂質(zhì)體，具有較高的細胞攝取率，其細胞轉(zhuǎn)染率高達90%以上[5]。細胞膜表面有大量帶負電的蛋白，陽離子型納米載體表面的正電荷可與這些蛋白通過靜電作用相互結(jié)合[3，9-10]，然后進入細胞內(nèi)部。相關(guān)文獻報道，表面帶正電的聚酰胺-胺樹狀大分子（PAMAM-NH2）在人非小細胞肺癌A549細胞中的攝取率明顯高于表面不帶電和帶負電的PAMAMNH2的細胞攝取率[11]。目前，關(guān)于陽離子型納米載體與細胞膜表面蛋白的靜電結(jié)合作用的報道較多，而關(guān)于結(jié)合之后陽離子型納米載體的細胞轉(zhuǎn)運全過程的報道較少。細胞轉(zhuǎn)運包括細胞攝取、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和細胞外排[4，12-15]這幾個過程，這些過程直接影響載體所攜帶藥物在胞內(nèi)的去向和抗腫瘤效果，因此，了解陽離子型納米載體在遞送抗腫瘤藥物過程中的細胞轉(zhuǎn)運機制十分重要。本研究以“陽離子載體”“細胞攝取”“胞內(nèi)轉(zhuǎn)運”“細胞外排”“Cationic carrier”“Cell uptake”“Intracellular transportation”“Exocytosis”等為關(guān)鍵詞，組合查詢2000年1月－2018年9月收錄在中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)、維普網(wǎng)、PubMed、Elsevier等數(shù)據(jù)庫中相關(guān)文獻。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻488篇，其中有效文獻44篇?，F(xiàn)對陽離子型納米載體在遞送抗腫瘤藥物過程中的細胞轉(zhuǎn)運機制及影響因素進行歸納總結(jié)，為陽離子型納米載體介導的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)的設計提供參考。

1 陽離子型納米載體的細胞攝取方式及影響因素

相關(guān)文獻報道，納米載體的細胞攝取方式主要有3種：（1）能量依賴的內(nèi)吞作用[4，13]；（2）細胞膜打孔[16-17]；（3）非能量依賴的膜移位[17]。陽離子型納米載體主要通過前2種攝取方式進入腫瘤細胞[17]，其中通過細胞膜打孔方式進入腫瘤細胞是陽離子型納米載體特有的腫瘤細胞攝取方式。

1.1 能量依賴的內(nèi)吞作用

小分子、大分子和顆粒狀物質(zhì)均能通過內(nèi)吞作用進入細胞[11]。根據(jù)內(nèi)吞物質(zhì)不同，內(nèi)吞作用分為吞噬作用和胞飲作用。內(nèi)吞大的顆粒狀物質(zhì)（＞200 nm）屬于吞噬作用，是白細胞攝取外源物質(zhì)的主要方式；內(nèi)吞細胞外的液體屬于胞飲作用，是大多數(shù)細胞攝取外源物質(zhì)的基本方式[18]。陽離子型納米載體可通過胞飲作用進入腫瘤細胞[11]，胞飲作用根據(jù)產(chǎn)生的機制可分為4種：網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用、小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用、巨胞飲作用、非網(wǎng)格蛋白和非小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用[11]。陽離子型納米載體則主要通過前3種機制進入細胞。

1.1.1 網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用 大多數(shù)腫瘤細胞表面特異性表達的受體，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、表皮生長因子受體、CD4受體、低密度脂蛋白受體等，都會觸發(fā)網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用[14，19-20]。因此連接有轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、CD4、低密度脂蛋白等配體的陽離子型納米載體，主要是通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞。當該陽離子型納米載體與細胞膜表面受體結(jié)合后，受體移動到細胞膜的有被小泡區(qū)，此處細胞膜內(nèi)表面的網(wǎng)格蛋白幫助細胞膜內(nèi)陷，形成由網(wǎng)格蛋白包裹的含有陽離子型納米載體為50～250 nm的有被小泡[4]，隨后進入細胞質(zhì)。

1.1.2 小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用 腫瘤細胞膜表面富含膽固醇和鞘脂類的光滑內(nèi)陷區(qū)被稱為小窩[4]，直徑一般為60～80 nm[18]，小窩內(nèi)主要含有小窩蛋白。相關(guān)文獻報道[14]，陰離子型納米載體多通過小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞，而陽離子型納米載體只有在特定的配體（氨肽酶、RGD環(huán)肽等）介導下才能通過該途徑進入腫瘤細胞。當配體介導的陽離子型納米載體到達小窩時，位于小窩頸部的發(fā)動蛋白會促使小窩從細胞膜上分離下來，形成小窩體，隨后到達細胞質(zhì)[21]。Liu C等[22]設計了cNGR肽介導的聚乳酸-聚乙二醇納米粒（cNGRPLA-PEG NPs），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該納米粒通過小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞。另有相關(guān)文獻報道[21]，小窩蛋白在一些特定的細胞表面含量較高，如腫瘤血管內(nèi)皮細胞或與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的成纖維細胞等，當陽離子型納米載體作用于這些細胞時，小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用就是其細胞攝取的主要途徑。

1.1.3 巨胞飲作用 巨胞飲途徑可非選擇性地內(nèi)吞營養(yǎng)物質(zhì)和大分子液體物質(zhì)。在正常情況下，陽離子型納米載體較少通過巨胞飲途徑進入細胞，只在某些刺激下會以該方式進入細胞[23]。巨胞飲過程開始時，細胞膜發(fā)生皺褶，形成大且不規(guī)則的無包被小泡，即巨胞飲體，直徑為0.5～10 μm。與前2種細胞攝取途徑相比，巨胞飲途徑形成的巨胞飲體的體積較大[14]，可包裹的物質(zhì)的總量更多，因此，若陽離子型納米載體以巨胞飲途徑進入腫瘤細胞，其在腫瘤細胞中的攝取量則會更多。

1.2 細胞膜打孔

通過細胞膜打孔方式進入腫瘤細胞，是陽離子型納米載體所特有的細胞攝取途徑。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[4，24]，陽離子型納米載體表面的正電荷可與細胞膜表面的負電荷結(jié)合，使細胞膜表面形成直徑為15～40 nm的孔，陽離子型納米載體可直接通過該孔進入細胞內(nèi)部。Hong S[25]等研究不同類型的PAMAM-NH2與人口腔表皮樣癌細胞KB的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著PAMAM-NH2濃度的增加，細胞內(nèi)的乳酸脫氫酶和熒光素酶泄漏量逐漸增加，小分子熒光探針碘化吡啶（PI）和二乙酸熒光素（FDA）的胞內(nèi)熒光強度發(fā)生改變，而表面不帶電的聚酰胺-胺樹狀大分子不會引起以上改變，由此說明，PAMAM-NH2增加了細胞膜的通透性；利用原子力顯微鏡觀察到PAMAM-NH2作用腫瘤細胞后，細胞表面產(chǎn)生了納米級別的孔，陽離子型納米載體可以通過該孔自由進出細胞，其他中性或者陰離子型納米載體不能誘導細胞膜產(chǎn)生孔，從而不能通過細胞膜打孔的方式進入細胞。

1.3 影響因素

陽離子型納米載體并非同時通過上述幾種途徑進入腫瘤細胞，在某一腫瘤細胞上的攝取途徑主要由陽離子型納米載體及其給藥系統(tǒng)的粒徑和腫瘤細胞的種類所決定。

1.3.1 陽離子型納米載體及其給藥系統(tǒng)的粒徑 由于各種內(nèi)吞途徑形成的內(nèi)吞小泡和細胞膜打孔形成的納米孔的大小是固定的，因此陽離子型納米載體的粒徑是影響其細胞攝取途徑的重要因素之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[26]，粒徑＜200 nm的陽離子型納米載體可通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞，但粒徑＞200 nm的陽離子型納米載體則會通過小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞。另外，陽離子型納米載體攜帶藥物構(gòu)成的給藥系統(tǒng)的粒徑大小也會影響其細胞攝取。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[27]，陽離子型納米載體攜帶DNA后形成的給藥系統(tǒng)，粒徑小于細胞膜打孔形成的納米孔的直徑（15～40 nm）時，可直接通過小孔直接進入腫瘤細胞，但當該給藥系統(tǒng)的粒徑大于該孔直徑時，給藥系統(tǒng)就只能通過網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞。

1.3.2 腫瘤細胞種類 由于不同腫瘤細胞的細胞膜表面所具有的蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量不同，因此，同一陽離子型納米載體在不同腫瘤細胞內(nèi)的內(nèi)吞途徑不相同。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[11]，PAMAM-NH2在人非小細胞肺癌細胞A549中通過非網(wǎng)格蛋白和非小窩蛋白依賴的內(nèi)吞作用進入細胞，在人乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ADR中主要通過巨胞飲進入細胞[23]，在小鼠黑色素瘤細胞B16F10中主要通過小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用進入細胞[28]。另外，陽離子型納米載體作用于與腫瘤生長發(fā)育密切相關(guān)的腫瘤組織血管內(nèi)皮細胞（含有豐富的小窩蛋白）時，主要通過小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用進入細胞[22]。

2 陽離子型納米載體的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機制及影響因素

胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程是陽離子型納米載體被攝取后，部分轉(zhuǎn)運至溶酶體，部分轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)或其他細胞器的過程。

第一個去向（即是否轉(zhuǎn)運進入溶酶體）主要受內(nèi)吞途徑的影響。通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞的陽離子型納米載體，會被包裹入有被小泡中，進入細胞質(zhì)，幾秒種后有被小泡失去衣被，成為光滑小泡，隨后與內(nèi)涵體融合，形成初級內(nèi)涵體，初級內(nèi)涵體在移動過程中逐漸被酸化，并最終與溶酶體融合，進入下一步轉(zhuǎn)運[29]。通過小窩蛋白介導的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞的陽離子型納米載體，會被包裹入小窩體內(nèi)，但小窩體在細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制目前仍然存在爭議[4]。有相關(guān)文獻認為，小窩體不與溶酶體融合，而是直接轉(zhuǎn)移到高爾基體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而避免載體被溶酶體降解[22，30]。通過巨胞飲途徑進入腫瘤細胞的陽離子型納米載體，會被包裹入巨胞飲體中，但是巨胞飲體的轉(zhuǎn)運過程是否與溶酶體融合的機制還需要進一步的研究[4]。

陽離子型納米載體進入腫瘤細胞溶酶體之后的去向基本相同。陽離子型納米載體表面帶正電，具有質(zhì)子海綿效應，使溶酶體膜溶脹或者膜通透性增強[23，31]，最終從溶酶體中逃逸出來，進入細胞質(zhì)中。另有研究發(fā)現(xiàn)，PAMAM-NH2可以進入腫瘤細胞的細胞核，具有一定的細胞核靶向性[23]，但關(guān)于這方面的報道較少，研究還有待進一步深入。

3 陽離子型納米載體的細胞外排機制及影響因素

腫瘤細胞在攝取外界物質(zhì)的同時也在不斷地向外排出物質(zhì)。細胞外排是一個能量依賴的過程，與細胞攝取作用相反[19，32-33]。

3.1 陽離子型納米載體的細胞外排途徑

納米載體的外排由多種細胞器參與[12，34]，陽離子型納米載體的細胞外排過程也一樣復雜多樣。未進入溶酶體的陽離子型納米載體，會被包裹進入胞內(nèi)小泡，一部分隨著胞內(nèi)小泡直接循環(huán)到細胞膜，隨后小泡與細胞膜融合形成外泌體，陽離子型納米載體被轉(zhuǎn)移到外泌體中，排出細胞[35]，但通過外泌體排出的陽離子型納米載體所占比例較低[36-37]；還有一部分會隨著胞內(nèi)小泡轉(zhuǎn)運至高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，再通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-細胞膜途徑，向細胞膜移動，與細胞膜接觸、融合，排到細胞外[12，23，34]。進入溶酶體的陽離子型納米載體大部分會逃逸溶酶體，最后通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-細胞膜途徑被排出細胞；極少部分不能逃逸溶酶體的會被溶酶體內(nèi)各種水解酶消化，然后帶有消化產(chǎn)物的溶酶體與腫瘤細胞的細胞膜接觸融合，將其釋放到腫瘤細胞外[12]。

此外，有一些陽離子型納米載體進入細胞后，會被水解或酶解成生物相容性單體，不能維持原有結(jié)構(gòu)，這些單體會被細胞排出。相關(guān)文獻報道[38]，陽性脂質(zhì)體進入人宮頸癌細胞HeLa和人結(jié)腸癌細胞HT-29后，脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)被破壞，降解成磷脂和膽固醇，然后被排到細胞外。另一些結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的陽離子型納米載體（如PAMAM-NH2）進入細胞后，仍然是以完整的納米載體形式，通過上述不同途徑被排出細胞[11，23]。

3.2 影響陽離子型納米載體細胞外排的因素

3.2.1 腫瘤細胞種類 陽離子型納米載體具有一定的細胞毒性，腫瘤細胞對其的外排其實也是一個排毒過程。腫瘤細胞種類不同，其解毒機制也不相同，因此，同一個陽離子型納米載體在不同腫瘤細胞內(nèi)的外排情況不同[12]。在細胞解毒機制中，細胞內(nèi)溶酶體參與的解毒過程對細胞外排速率的影響最大；溶酶體膜穩(wěn)定性和溶酶體內(nèi)酶含量不同，可導致陽離子型納米載體的細胞外排量不同[12]。Yanes RE等[15]檢測了腫瘤細胞種類對磷酸修飾的二氧化硅納米粒外排的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，溶酶體內(nèi)的β-氨基己糖苷酶含量對該納米粒外排有很重要的影響，該酶含量不同的人非小細胞肺癌細胞A549、人乳腺癌細胞MCF-7、人黑色素瘤細胞MDA-MB435和人胰腺癌細胞PANC-1對磷酸修飾的二氧化硅納米粒的外排率分別是87%、75%、61%和36%。

3.2.2 陽離子型納米載體的粒徑 陽離子型納米載體的粒徑對其腫瘤細胞外排有一定的影響。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，小粒徑的陽離子型納米載體更容易被細胞外排，且外排率比大粒徑載體外排率要高[12]。Ling H等[39]檢測了不同粒徑的介孔氧化硅納米粒在人肝癌細胞HepG2中的外排情況，60、180、370、600 nm的納米粒的外排率分別是63%、67%、58%、38%。載體在腫瘤細胞內(nèi)有兩種循環(huán)過程，一種是經(jīng)內(nèi)涵體-溶酶體途徑進入到細胞質(zhì)，外排速率較快；另一種是經(jīng)內(nèi)涵體-溶酶體途徑到細胞膜表面，外排速率較慢。Panyam J等[40]研究發(fā)現(xiàn)，粒徑較大的陽離子型納米載體會被轉(zhuǎn)運到細胞膜表面，導致其外排速率較慢。

3.2.3 陽離子型納米載體的形狀 陽離子型納米載體的形狀是影響其在腫瘤細胞外排的另一個因素。Chithrani BD等[41]研究了不同形狀的金納米粒在人宮頸癌細胞HeLa和人膠質(zhì)瘤細胞SNB19中的外排情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，棒狀的金納米粒在這2種細胞中的外排率明顯高于球狀納米粒。Seib FP等[28]研究了樹枝狀和線性狀的聚乙烯亞胺（PEI）在小鼠黑色素瘤細胞B16F10中的外排情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1 h內(nèi)，這2種形狀的PEI外排變化趨勢和外排率相似。因此，陽離子型納米載體的形狀如何影響其腫瘤細胞外排，需要進一步分析，另外關(guān)于載體形狀對腫瘤細胞外排影響的機制，目前研究較少，還需要深入研究。

3.2.4 陽離子型納米載體的胞內(nèi)分布 陽離子型納米載體經(jīng)過不同的內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞后，有些被轉(zhuǎn)移到溶酶體，有些被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)的細胞器中。相關(guān)研究報道[42-44]，進入溶酶體的陽離子型納米載體最容易被外排，進入線粒體的陽離子型納米載體比細胞質(zhì)中的更容易被外排。

4 討論

近年來，腫瘤的發(fā)生機制已經(jīng)由組織學水平逐漸發(fā)展到細胞學水平。因此，腫瘤靶向給藥系統(tǒng)已經(jīng)不再是傳統(tǒng)的攜帶藥物到達靶組織，還應攜帶藥物進入靶細胞，同時控制藥物在細胞內(nèi)靶細胞器的分布和釋放。明確陽離子型納米載體的細胞轉(zhuǎn)運機制，可以根據(jù)其轉(zhuǎn)運機制有針對性地設計給藥系統(tǒng)。此外，腫瘤細胞內(nèi)有很多細胞器均有膜結(jié)構(gòu)且?guī)в须姾桑栯x子型納米載體表面的正電荷可能會與其細胞器膜發(fā)生靜電吸附作用，從而對細胞器產(chǎn)生一定的靶向作用，但該作用機制仍需要進一步深入研究，以期為開發(fā)靶向性更強、抗腫瘤效果更好的腫瘤靶向給藥系統(tǒng)提供參考。