羊口瘡的免疫防治研究進展

陳勇，陳小云

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

羊口瘡(Orf)又稱為羊傳染性膿皰皮炎(Contagious Ecthyma)，是一種接觸性傳染病，由痘病毒科副痘病毒屬的羊口瘡病毒(orf virus, ORFV)引起。ORFV為雙股線性DNA病毒，有囊膜，基因組大小約為134～139 kb，其中C+G約占總核酸的64%，有16個開放閱讀框(open reading frames, ORFs)[1-2]。ORFV不僅感染綿羊、山羊、鹿以及其他小反芻動物，而且可以感染人類，是一種人獸共患病[3]。該病的發(fā)病機制尚不清楚，感染病例出現(xiàn)紅斑、丘疹、水泡、膿皰、最后形成結(jié)痂，病程通常為3～4周，幼齡動物感染發(fā)病的風(fēng)險更高，嚴(yán)重時會造成死亡，在一些人類感染的病例中，嚴(yán)重的免疫抑制可導(dǎo)致高度血管化，異常增生的滲液結(jié)節(jié)，成為巨結(jié)節(jié)等皮膚疾病[4-6]。有研究發(fā)現(xiàn)該病存在隱性感染，沒有癥狀的動物也可能攜帶致病病毒，并且該病毒引起的病毒血癥還會持續(xù)較長一段時間[6]。該病發(fā)病率高，病死率低，但分布廣泛，幾乎在全世界的養(yǎng)羊區(qū)域均有該病的報道，其對世界的畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟損失[7]。

由于目前沒有用于ORFV感染治療的特效藥，所以防治該病的最好方式還是接種疫苗[8]。疫苗接種可以使患病羊只更快恢復(fù)，從而減少疾病造成的損失。給產(chǎn)羔前至少8周的母羊和出生第2天之后的羔羊接種疫苗，再加上合理的飼養(yǎng)管理可以大大減少羊口瘡的流行[9]。隨著生物科技的發(fā)展，傳統(tǒng)疫苗不斷改良，新型疫苗不斷出現(xiàn)，羊口瘡疫苗的研制也在不斷地進步，因此本文對羊口瘡疫苗的研究進展進行了綜述。

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 滅活疫苗 滅活疫苗主要是由強毒株病原經(jīng)滅活劑處理后制備的疫苗。滅活疫苗制作比較簡單使用安全，但是存在著免疫保護時間短、所需劑量大、免疫效果不佳等缺點，因此大部分滅活疫苗需要與佐劑搭配使用。1978年，Lejanr等將患病羊的血清、乳汁以及初乳熱滅活制作成滅活疫苗，用其免疫23只孕羊之后檢測孕羊的血清和初乳，僅有15只孕羊血清、10只孕羊的初乳中檢測出了中和抗體；檢測出生的27只羔羊有9只血清中含有中和抗體，說明羔羊只能通過初乳獲得中和抗體[10]。2014年賈云曉等使用0.4%的甲醛與病毒液混合48小時將病毒滅活，分別混合鋁膠鹽佐劑和轉(zhuǎn)移因子佐劑制成滅活苗，用其免疫孕羊，頸部皮下注射免疫，連續(xù)免疫三次，每次間隔 14 d，鋁膠鹽羊口瘡病毒滅活疫苗免疫劑量為 1 mL/頭，轉(zhuǎn)移因子佐劑羊口瘡病毒滅活疫苗免疫劑量為 2 mL/頭，結(jié)果免疫后中和抗體效價分別達到 1∶24.5和 1∶24.75，且免疫組發(fā)病率為20%，對照組發(fā)病率為35.48%[11]。李娜等2016年用0.4%的甲醛滅活病毒后使用Montanide ISA 201 VG 佐劑配備水包油包水劑型疫苗，用Montanide ISA 11 R佐劑制備水包油劑型疫苗，用兩種疫苗分別給2～3月齡羊羔各6只進行皮下注射，對照組羊羔皮下注射等量的生理鹽水，免疫21 d后進行攻毒，結(jié)果對照組全部發(fā)病，201佐劑疫苗保護率為67%，11R佐劑疫苗保護率為50%[12]。

1.2 弱毒活疫苗 弱毒活疫苗是強毒株經(jīng)過人工傳代培養(yǎng)致弱或從自然界分離的弱毒珠制成的活疫苗。弱毒活疫苗具有免疫周期長，免疫效果較好的特點，故其成為控制羊口瘡流行最常用的疫苗。目前大多數(shù)弱毒活疫苗都采取傳代致弱的方式得到弱毒珠，傳代細(xì)胞的選擇各不相同。Mercante等在2008年通過原代雞胚成纖維細(xì)胞組織培養(yǎng)的一系列傳代，對一野毒株進行減毒制成弱毒活疫苗，用其免疫5只綿羊和5只山羊，30 d 后進行攻毒試驗，結(jié)果免疫羊只均未出現(xiàn)臨床癥狀[13]。2013年田婷婷等使用犢牛睪丸原代細(xì)胞將FX0910毒株傳至85代致弱，免疫1月齡羔羊120只，免疫方式為下唇內(nèi)側(cè)“#”劃痕，共免疫兩次每次間隔一周，通過對照發(fā)現(xiàn)該弱毒活疫苗對羔羊的免疫保護率為98%[14]。

同一毒株，不同的致弱方式對弱毒活疫苗的效果有影響。2012年Housaw等研究比較了三種同一毒株不同方法制備的弱毒活疫苗，其中兩種疫苗由野毒株在Vero細(xì)胞培養(yǎng)中分別傳代20次和75次制備，第三種由病羊結(jié)痂在pH7.4的緩沖液中制成50%(W/V)懸浮液后配以甘油緩沖液制成疫苗儲存在4 ℃環(huán)境中，結(jié)果在Vero細(xì)胞傳代20次的弱毒活疫苗效果最好，它使得患病持續(xù)時間明顯減少[15]。不同毒株制成的疫苗對山羊和綿羊保護力度也不同。Jeffrey等使用5種不同ORFV毒株攻毒健康羊只，取病羊痂皮配以甘油緩沖液制成的減毒活疫苗，用大腿內(nèi)側(cè)皮膚劃傷接種的方式免疫羊羔，發(fā)現(xiàn)47CE毒株制成的弱毒活疫苗與其他毒株相比能更好地保護山羊免受ORFV的侵襲[16]。

2 新型疫苗

2.1 DNA疫苗 DNA疫苗是指將病原保護基因插入真核表達載體后制備的疫苗，由于其易于制造、能在常溫下保存、可以模擬自然感染產(chǎn)生免疫的特性使得DNA疫苗關(guān)注度很高，但其臨床試驗并未取得理想效果，目前僅有幾種獸用DNA疫苗獲得生產(chǎn)許可[17]。2011年Zhao等構(gòu)建了3個真核表達載體pcDNA3.1-ORFV011、pcDNA3.1-ORFV059和pcDNA3.1-ORFV011/ORFV059，分別給小鼠免疫接種后進行攻毒，接種了pcDNA3.1-ORFV011/ORFV059的免疫應(yīng)答明顯增強，說明表達ORFV011和ORFV059化學(xué)蛋白的DNA疫苗pcDNA3.1-ORFV011/ORFV059可顯著提高DNA疫苗免疫接種效力，表明DNA疫苗可以作為羊口瘡免疫防治方法之一[18]。李鵬飛等在2018年克隆ORFV的B2L基因片段至PVAX1載體中構(gòu)建PVAX1-B2L重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入MDBK細(xì)胞中進行轉(zhuǎn)錄和表達，將構(gòu)建的DNA疫苗免疫KM系小鼠，采用間接ELISA、MTT和FACS法對其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答進行了研究，發(fā)現(xiàn)該DNA疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[19]。

2.2 基因工程疫苗 基因工程疫苗包括基因重組疫苗和基因缺失疫苗。基因重組疫苗是將病原的保護性基因片段插入活載體而制成的基因重組活載體疫苗。利用載體建立新的表達重要ORFV蛋白的重組病毒是制備基因重組疫苗的方法之一，2018年陳曉等應(yīng)用PCR擴增了ORFV-F416毒株的F1L、B2L目的基因然后構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒，穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HEK-293細(xì)胞，包裝出與ORFV的F1L、B2L基因串聯(lián)表達的重組腺病毒，用其免疫小鼠后分別檢測小鼠的IgG、T淋巴細(xì)胞，其免疫球蛋白與T淋巴細(xì)胞水平均明顯增高，隨后對小鼠做攻毒保護試驗發(fā)現(xiàn)免疫后的小鼠未影響正常采食[20]。大多數(shù)單分子蛋白質(zhì)和多肽需要與大分子載體的化學(xué)偶聯(lián)或配合佐劑的應(yīng)用才能引起強烈的免疫反應(yīng)，利用重組DNA技術(shù)已經(jīng)證明，將外源表位插入具有多種功能化能力的載體蛋白中，如病毒的衣殼或包膜蛋白，可以增強其免疫原性[21]。由于ORFV的基因組特點、編碼基因復(fù)制特性使其在宿主和非宿主體內(nèi)快速引發(fā)免疫反應(yīng)，其作為活載體還有不造成病毒感染全身化、具有嚴(yán)格的宿主選擇性、不與其他痘病毒屬交叉反應(yīng)等優(yōu)勢，故目前基于ORFV作為載體的基因重組活載體疫苗研究比較多[22-24]。使用ORFV作為活載體可以制成多聯(lián)疫苗，如2012年Tan等將細(xì)粒棘球絳蟲的抗原基因EG95與ORFV膜結(jié)構(gòu)蛋白基因融合，使細(xì)粒棘球絳蟲的EG95蛋白自身表達或與ORFV表面蛋白10 kD或F1L融合表達，用其免疫綿羊，可以檢測到針對ORFV和細(xì)粒棘球絳蟲的中和抗體，說明接種該雙聯(lián)疫苗可能具有保護羔羊免受ORFV與細(xì)粒棘球絳蟲的感染[25]。ORFV作為活載體也能制成針對其他病原的重組疫苗，Rohde等在2011年使用ORFV作為活載體插入兔出血癥病毒(RHDV)的主要衣殼蛋白VP1 基因，利用ORFV載體系統(tǒng)成功產(chǎn)生了RHDV的重組疫苗[26]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展特別是基因編輯技術(shù)的不斷革新，將病毒毒力基因敲除制成基因缺失疫苗變得炙手可熱，目前基因缺失疫苗大多為多基因缺失疫苗。現(xiàn)在研究較多的是豬偽狂犬病毒的多基因缺失疫苗，2016年Tang等使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功構(gòu)建了弱毒偽狂犬活病毒，他們用特定的sgRNA來定位gE、gI和TK基因的開放閱讀框，以此引導(dǎo)Cas9蛋白對這三個偽狂犬毒力基因進行敲除，然后用Vero細(xì)胞對編輯純化后的病毒進行增殖培養(yǎng)，為測試gE-/gI-/TK-PRV疫苗保護效果，選取6～8周齡的BALB/c雌性小鼠共10只進行免疫接種，三周后對免疫小鼠攻毒，所有免疫后的小鼠均未發(fā)病，說明該三基因缺失疫苗能提供完全的免疫保護[27]。這為同為雙股線性DNA病毒的羊口瘡病毒疫苗研制提供了新思路。

2.3 亞單位疫苗 ORFV是一種大型病毒,它含有許多不同的毒性因子和免疫原蛋白。ORFV亞單位疫苗研究已有多年，早在1988年我國學(xué)者左玉婷等使用30%～45% 蔗糖密度梯度離心純化收集羊口瘡病毒，然后用中性去污劑裂解病毒，經(jīng)過離心收集上清液即為病毒囊膜，用該ORFV囊膜亞單位蛋白混合弗式佐劑免疫羊只，50%以上的羊只出現(xiàn)了遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，用ELISA測定免疫后的抗體滴度，證明分離得到的羊口瘡病毒囊膜亞單位具有激發(fā)羊只產(chǎn)生抗病毒抗體的活性[28]。ORFV囊膜蛋白F1L具有高度的免疫原性，將這個基因PCR擴展后克隆到C端融合有6個組氨酸標(biāo)記的pCR T7/CT-TOPO載體上。重組質(zhì)粒在選擇性培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10F'增殖，用純化的重組質(zhì)粒10 ng轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 50 mL，表達基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌質(zhì)粒中可以大量表達這種蛋白，將培養(yǎng)物離心層析后純化的F1L配合Gerbu佐劑免疫兩種家兔，接種方式是第一次為皮下接種，第3到5周加大劑量進行補充皮下接種，最后一次為靜脈接種，病毒中和試驗表明，兩種動物對該亞單位疫苗均產(chǎn)生了中和抗體，其效價分別為1∶100和1∶1000[29]。

3 展 望

由于獨特的免疫特性以及較大的基因組，ORFV成為了重組活載體疫苗研究領(lǐng)域中的“明星”載體[29-31]，研究發(fā)現(xiàn)滅活的ORFV有著提高疫苗免疫效果的佐劑功能，甚至還有ORFV可以通過增強細(xì)胞因子分泌和有效激活自然殺傷(NK)細(xì)胞來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的報道[32-34]。在大多數(shù)情況下認(rèn)為ORFV只會引起局部輕微的皮膚感染，導(dǎo)致人們對該病毒感染沒有給予足夠的重視，但這種病毒感染已成為造成嚴(yán)重疾病的重要誘因之一，它使得羊毛、獸皮和肉類大量減產(chǎn) ，對畜牧業(yè)產(chǎn)生重大影響。近年來，ORFV也因具有跨種屬傳播和人畜共患病的潛在威脅而備受關(guān)注。為了應(yīng)對不斷出現(xiàn)和重現(xiàn)的羊口瘡疾病威脅，用疫苗進行免疫接種仍將是未來最重要的疾病控制措施?，F(xiàn)在大多采取弱毒活疫苗進行防治，但是經(jīng)過傳代致弱的病毒都存在毒力返強的風(fēng)險，所以開發(fā)新型疫苗勢在必行。

病毒干擾素抑制蛋白 (OVIFNR，ORF020)與病毒復(fù)制中間體結(jié)合從而阻止IFN干擾病毒蛋白翻譯[35]；趨化因子結(jié)合蛋白(CBP，ORF112)能結(jié)合和抑制趨化因子[36]；GM-CSF/IL-2抑制蛋白(GIF，ORF117)可以抑制GM-CSF和IL-2的活性[37]；病毒白細(xì)胞介素10 (10vIL-10，ORF121)抑制免疫應(yīng)答[38-39]；血管內(nèi)皮生長因子 (VEGF，ORF132)會引起血管內(nèi)皮增加，血管通透性增加[40]；同時研究發(fā)現(xiàn)ORFV編碼的ORFV057蛋白具有阻斷IFN刺激基因ISGs表達和調(diào)節(jié)Janus激酶/信號轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活(JAK/STAT)信號通路的功能，即通過在不需要新的病毒基因表達的感染細(xì)胞中將STAT1去磷酸化以此來抑制干擾素的表達，進而達到免疫逃逸的目的[41]。此等皆為ORFV的毒力基因，這些毒力基因從各個方面阻斷或干擾機體免疫系統(tǒng)的正常運行，用基因工程技術(shù)將某個或某些毒力基因敲除或使其毒力減弱制成基因缺失疫苗有著安全有效、免疫持久和毒力不會返強等優(yōu)點，這或?qū)⒊蔀槲磥鞳RFV疫苗的方向之一。B1L、B2L是ORFV的兩種囊膜蛋白，若以其他病毒為運載體將這兩種膜蛋白基因插入其中，這樣制成的基因重組活疫苗不僅可以預(yù)防ORFV的多種毒株而且可以穩(wěn)定地刺激宿主免疫系統(tǒng)從而提供免疫保護。雖然這種活載體疫苗的安全性還未得到長期的驗證，但由于其廣闊的應(yīng)用前景使得基因重組疫苗將會得到更深入的研究?？傊?，隨著疫苗研究技術(shù)的發(fā)展，未來將會開發(fā)出更多安全、高效的羊口瘡疫苗，羊口瘡也會因此得到有效防控。