植物調(diào)節(jié)劑分期施用對玉米籽粒胚乳及淀粉粒發(fā)育的影響

劉曉慶，詹延廷，王 月，王 萍，殷詩凱，韓彩霞，董學會

(中國農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，北京 100193)

乙烯利是大田作物常用調(diào)節(jié)劑，在玉米營養(yǎng)生長時期噴施乙烯利能夠降低株高、穗位高和倒伏率[1-2]。許多研究結(jié)果顯示,噴施乙烯利在降低玉米株高的同時會導致產(chǎn)量的下降[3-5]。Kasele等[4]研究了在干旱條件下玉米噴施乙烯利之后對玉米產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)在低種植密度(24 700株/hm2)下的玉米籽粒產(chǎn)量隨著乙烯利濃度的升高(從280 g/hm2提高到560 g/hm2)下降非常顯著(從2.92 mg/hm2下降到2.34 mg/hm2)。Langan等[5]研究發(fā)現(xiàn)，使用乙烯利之后玉米在連續(xù)2年中倒伏率分別降低85%,93%，產(chǎn)量分別下降6%,2%。在小麥和大麥以及其他作物的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的情況[6-7]。Tripathi等[6]研究發(fā)現(xiàn),噴施乙烯利之后，小麥的株高降低，倒伏率下降，產(chǎn)量下降8.3%。由此可見，乙烯利對降低株高和產(chǎn)量的影響是非常普遍的。

針對乙烯利能夠降低株高的顯著效果以及其在玉米產(chǎn)量上存在的問題，生產(chǎn)上推出了以乙烯利為主的復配植物生長調(diào)節(jié)劑如玉米壯豐靈[8]、玉米健壯素[9]、玉黃金(27%乙烯利+3%胺鮮酯)[10]，但是由于這類復配劑存在應用窗口期短、后期操作困難、效果不穩(wěn)定等問題，影響產(chǎn)品的推廣。對壯豐靈的研究結(jié)果顯示，在吉林省種植玉米噴施壯豐靈的最佳時間是7月5-10日，過早或者過晚都會影響其效果[8]。玉黃金在玉米的4展葉+10展葉以及6展葉+10展葉時期同時噴施則會提高玉米的產(chǎn)量而單獨在4展葉、6展葉或者10展葉時期噴施都會導致減產(chǎn)[10]。因此，研究乙烯利影響籽粒發(fā)育及產(chǎn)量的生理機制，可為形成方便、有效、廣譜的以乙烯利為主的玉米調(diào)節(jié)技術(shù)提供理論依據(jù)。

玉米籽粒發(fā)育過程是庫建成和物質(zhì)積累的過程，形成足夠的籽粒庫容是提高粒質(zhì)量的基礎(chǔ)，也是產(chǎn)量的主要影響因素之一[11-13]。籽粒庫容可表示為單位面積穗數(shù)×穗粒數(shù)×單粒體積，單粒體積由籽粒中胚乳細胞、淀粉粒的數(shù)目和大小決定[11]。胚乳細胞大小、數(shù)目以及淀粉粒的數(shù)目是評價籽粒充實程度的一個重要指標[14-15]。玉米的庫容量在理想環(huán)境下是由遺傳決定的，但是在田間環(huán)境下庫容的大小受環(huán)境如水分虧缺[16]、熱脅迫[17]影響顯著，進而對產(chǎn)量造成影響。Reddy等[18]通過研究籽粒大小與胚乳細胞數(shù)量和淀粉顆粒之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)淀粉粒的數(shù)目比胚乳細胞的數(shù)目對籽粒的發(fā)育和干質(zhì)量的影響更大。因而，胚乳細胞的數(shù)目以及淀粉粒的數(shù)目和大小可以影響庫容的大小進而影響籽粒的灌漿過程，最終影響籽粒干物質(zhì)的積累。

本研究以玉米自交系B73為試驗材料，在拔節(jié)期用乙烯利處理，研究乙烯利對庫容和物質(zhì)積累的影響，并比較吐絲期噴施1-MCP、6-BA和ABA結(jié)合拔節(jié)期乙烯利處理對玉米籽粒灌漿速率、胚乳細胞及淀粉粒發(fā)育的影響，以期為乙烯利影響玉米籽粒發(fā)育機制和乙烯利復合調(diào)節(jié)劑的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為玉米自交系B73，生育期130～135 d，植株高度210 cm，穗位80 cm，葉片平直，葉片數(shù)21片左右。籽粒半馬齒型，籽粒黃色，長楔形。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在中國農(nóng)業(yè)大學上莊實驗站進行，共設(shè)5個處理，每個處理3次重復，小區(qū)面積50 m2。于2017年5月5日播種，按450 kg/hm2用量施用復合肥作基肥，小口期追施尿素375 kg/hm2，其他正常田間管理，進行人工授粉。處理A：對照組(CK)，拔節(jié)期(以下同時間)噴施清水+吐絲期噴施清水；處理B：拔節(jié)期整株噴施600 mg/L乙烯利(ETH)+吐絲期噴施清水；處理C：拔節(jié)期噴施600 mg/L乙烯利(ETH)+吐絲期噴施8 mg/L 1-MCP；處理D：拔節(jié)期噴施600 mg/L乙烯利(ETH)+吐絲期噴施60 mg/L 6-BA；處理E：拔節(jié)期噴施600 mg/L乙烯利(ETH)+吐絲期噴施25 μmol/L ABA。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣方法 分別于授粉后4(DAP 4)，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44 d選取植株長勢一致、穗長發(fā)育情況一致的玉米雌穗，取樣位于雌穗下部約1/3處，剝?nèi)∽蚜?，備用?/p>

1.3.2 籽粒干質(zhì)量以及灌漿速率 從穗部取下的籽粒直接稱取鮮質(zhì)量后，將籽粒置于80 ℃烘箱，待籽粒質(zhì)量恒定之后稱取籽粒的干質(zhì)量。籽粒灌漿速率=(后一次取樣百粒干質(zhì)量-前一次取樣百粒干質(zhì)量)/取樣間隔。進行3次生物學重復。

1.3.3 胚乳細胞數(shù)目的計數(shù)及面積的統(tǒng)計 胚乳細胞的分離和計數(shù)：參考Singh等[19-20]的方法，并有所改進。在授粉后8，12，16 d，從各處理組的果穗下部1/3處取籽粒，每個處理組各取來自6個不同果穗的10粒籽粒備用，F(xiàn)AA(福爾馬林∶冰醋酸∶乙醇=5∶5∶90，V/V/V)固定液抽氣固定，測定時用蒸餾水浸泡24 h，剝?nèi)ヅ吆头N皮，用5 mL蒸餾水清洗3次，加入5 mL的翰生(Hansen)氏蘇木精染色液，染色24 h。蒸餾水中分色至澄清。加入5 mL 0.1%的纖維素酶液(用磷酸-檸檬酸緩沖液 pH值5.0配置)，在40 ℃下振蕩4～6 h，使胚乳細胞離解充分。通過細胞計數(shù)板計數(shù)胚乳細胞數(shù)。

胚乳細胞面積的統(tǒng)計：隨機取授粉后36 d籽粒10粒，制作石蠟切片，I2染色后取籽粒中部1/2處從糊粉層細胞向內(nèi)第8至第10層的淀粉質(zhì)胚乳細胞用于分析。用OLYMPUS-UB100i顯微鏡進行拍照，細胞面積用MOTIC軟件進行測量統(tǒng)計。

1.3.4 淀粉粒的計數(shù) 在玉米授粉后灌漿前期12 d(此時淀粉粒數(shù)目不斷增加、體積不斷增大)和灌漿后期36 d(淀粉粒數(shù)目不再增加，淀粉粒體積增大不明顯)，取各處理組中玉米穗下部1/3處籽粒10粒，制作石蠟切片并用PAS(Periodic Acid-Schiff stain)染色，切片位置為籽粒的居中縱切，用OLYMPUS-UB100i顯微鏡進行拍照。計數(shù)不同籽粒的相同位置共計120個細胞(每個籽粒統(tǒng)計12個胚乳細胞)，記錄胚乳細胞內(nèi)淀粉粒數(shù)目，并測量胚乳細胞面積。進行3次生物學重復。

1.3.5 淀粉粒的提取及分析 淀粉粒的提取方法參照Yang等[21]。取各處理組中授粉后12,36 d的胚乳，在40 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中分散過夜。用磨樣機將樣品研磨充分后，將混合物用直徑為74 μm的濾網(wǎng)過濾，濾液室溫下10 000 r/min離心10 min。沉淀依次用2 mol/L NaCl 10 mL、2% (m/V) SDS 10 mL和0.2 mol /L NaOH 10 mL洗脫，10 000 r/min離心10 min，重復3次。加入10 mL丙酮，棄去有機層并風干。進行3次生物學重復。淀粉粒的粒度分析采用馬爾文Master-sizer Hydro 2000進行。淀粉粒的檢測用水作為分散劑，采用儀器本身攜帶的軟件輸出試驗結(jié)果。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，并用Excel 2010軟件進行作圖，采用Duncan法進行顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)節(jié)劑處理對玉米百粒質(zhì)量的影響

在籽粒形成期，玉米百粒質(zhì)量在各個處理組中差異不顯著(圖1-A)。隨著灌漿時間的延長，逐漸表現(xiàn)出差異顯著性。在DAP 20，與CK相比處理B的百粒質(zhì)量下降顯著，約下降15.4%。在灌漿末期DAP 44，處理B與CK相比百粒質(zhì)量下降約11.3%(圖1-A)。處理C的百粒質(zhì)量在DAP 44與對照相比下降約4.8%，表現(xiàn)出差異顯著性，并且顯著高于乙烯利處理(圖1-B)。這說明乙烯受體抑制劑1-MCP可以促進籽粒干物質(zhì)的積累，可以在一定程度上補償乙烯利造成的產(chǎn)量下降。在DAP 44，處理D籽粒百粒質(zhì)量與CK相比差異不大(圖1-C)，并且顯著高于乙烯利處理，說明6-BA可以彌補乙烯利導致的籽粒干質(zhì)量的下降。由圖1-D可知，處理E的百粒質(zhì)量與處理B在整個灌漿過程中均沒有表現(xiàn)出顯著差異，這說明ABA不能提高或者恢復乙烯利造成的產(chǎn)量的下降，與乙烯利處理玉米百粒質(zhì)量差異不大?？傮w看來，6-BA的使用對改善前期乙烯利處理對百粒質(zhì)量造成的下降有顯著作用，1-MCP處理對改善前期乙烯利處理造成的百粒質(zhì)量的下降有一定的效果，ABA處理則影響不顯著。

不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖3-5同。Different letters indicate significant difference among different treatments at P<0.05 .The same as Fig.3-5.

2.2 調(diào)節(jié)劑處理對玉米灌漿速率的影響

從整個發(fā)育期來看，玉米灌漿速率在各個處理組中變化趨勢基本一致，均為雙峰曲線。在DAP 20籽粒灌漿速率達到第1個峰值，處理B與CK灌漿速率呈顯著差異性，處理B的灌漿速率與CK相比下降約17.7%；在DAP 32，籽粒灌漿速率達到第2個峰值，處理B的灌漿速率與CK相比下降約24.3%，同樣顯著低于CK(圖2-A)。在DAP 20，處理C中灌漿速率與CK無顯著差異，在DAP 24顯著高于CK，而在DAP 32顯著低于CK(圖2-B)。處理D的灌漿速率在DAP 16和DAP 20與處理B差異不顯著，與CK差異顯著；在DAP 24和DAP 28灌漿速率顯著高于CK和處理B；在DAP 32則顯著低于CK(圖2-C)。處理E的灌漿速率與CK相比波動較大，處理E灌漿速率的第2個峰值出現(xiàn)在DAP 28，而CK出現(xiàn)在DAP 32，這說明ABA處理之后灌漿時間有可能縮短(圖2-D)。

圖2 調(diào)節(jié)劑處理對玉米籽粒灌漿速率的影響Fig.2 Effect of plant growth regulators on maize grain filling rate

2.3 調(diào)節(jié)劑處理對胚乳細胞的數(shù)目及面積的影響

由圖3-A可知，在DAP 8，處理D與CK差異不顯著，處理B與處理C無顯著差異同時均顯著低于CK和處理D。在DAP 12，處理B與CK相比胚乳細胞數(shù)目顯著下降約22.9%；處理C的胚乳細胞數(shù)目顯著高于處理B同時顯著低于CK，與處理B相比高約20.9%，與CK相比低約12.8%。在DAP 12，處理D的胚乳細胞數(shù)目與CK差異不顯著。在DAP 12，處理E中胚乳細胞數(shù)目與處理B差異不顯著，同時顯著低于CK、處理C以及處理D。在DAP 16，各處理組中的胚乳細胞數(shù)目與DAP 12時的胚乳細胞數(shù)目相比差異不大。

在授粉后36 d，從整體來看，各個處理組中胚乳細胞面積多集中在0.25×104～3.25×104μm2。由圖3-B可知，處理B中在Ⅳ范圍內(nèi)的胚乳細胞數(shù)目所占百分數(shù)顯著高于CK，而在Ⅵ范圍內(nèi)的胚乳細胞數(shù)目所占百分比顯著低于CK。處理C中在Ⅳ范圍內(nèi)的胚乳細胞數(shù)目所占百分比顯著高于CK同時與處理B無顯著差異，處理C中在Ⅴ范圍內(nèi)的胚乳細胞數(shù)目所占百分比顯著高于CK與處理B，在Ⅵ范圍內(nèi)的胚乳細胞數(shù)目所占百分比顯著低于CK而高于處理B。處理D的胚乳細胞數(shù)目所占百分比在Ⅳ、Ⅴ范圍內(nèi)的均顯著高于CK，與CK相比分別高約27.8%和19.3%，而在Ⅵ范圍內(nèi)低于CK約61.9%。處理E在Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ范圍內(nèi)的胚乳細胞數(shù)目所占百分比與處理B無顯著差異(圖3-B)。

圖3 胚乳細胞數(shù)目以及面積所占百分比Fig.3 Endosperm cell number and the percentage of endosperm cell area

2.4 調(diào)節(jié)劑處理對淀粉粒數(shù)目的影響

由圖4-A可知，在DAP 12，胚乳細胞內(nèi)淀粉粒數(shù)目較少。在Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ范圍內(nèi)，CK、處理C以及處理D的淀粉粒數(shù)目無顯著差異并且均顯著高于處理B和處理E，同時，處理B和處理E之間沒有顯著差異。在DAP 36，胚乳細胞面積多集中在1.25×104～2.75×104μm2(圖3-B)，這個范圍里細胞內(nèi)的淀粉粒的數(shù)目基本決定整個胚乳的淀粉粒數(shù)目。在Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ范圍內(nèi)的淀粉粒數(shù)目在CK、處理C和處理D之間無顯著差異，均顯著高于處理B和處理E(圖4-B)。在處理B、處理D和處理E中，沒有檢測到在X范圍內(nèi)的胚乳細胞，加之該范圍內(nèi)細胞比例很小，對總淀粉粒數(shù)目影響不顯著。

圖4 胚乳細胞面積與淀粉粒的關(guān)系Fig.4 The relationship of endosperm cell number area and starch granule number

2.5 調(diào)節(jié)劑處理對淀粉粒的形態(tài)分布影響

淀粉粒的直徑分布范圍如圖5所示，在DAP 12，淀粉粒直徑范圍分布較小，多集中在2.89～7.59 μm，CK中在K范圍的淀粉粒數(shù)目所占百分比最高，處理B在I范圍的淀粉粒數(shù)目所占百分比最高。在E、F、G、H范圍內(nèi)處理B的淀粉粒數(shù)目所占百分比顯著高于CK，但是在J、K、L范圍內(nèi)的淀粉粒數(shù)目所占百分比顯著低于CK，這說明CK的平均淀粉直徑顯著大于處理B(圖5-A)。在處理C和處理D中，淀粉粒在不同粒徑范圍下的數(shù)目所占百分比與CK差異不大。處理E淀粉粒直徑在F～L范圍內(nèi)的數(shù)目所占百分比與處理B差異不顯著，且在K、L范圍內(nèi)的淀粉粒數(shù)目所占百分比顯著低于CK，特別是在L范圍內(nèi)處理E的淀粉粒數(shù)目所占百分比與對照相比下降約75.8%，這說明后期ABA處理不能恢復乙烯利對淀粉粒直徑造成的改變(圖5-A)。

在DAP 36，CK在R范圍的淀粉粒數(shù)目所占百分比最高，處理B在M范圍的淀粉粒數(shù)目所占百分比最高(圖5-B)。處理B中淀粉粒數(shù)目所占百分比在C～M范圍內(nèi)均顯著高于CK，在P～V范圍內(nèi)的百分比顯著低于CK，特別是在M范圍的所占百分比高于CK約46.3%，在R范圍的所占百分比低于CK約61.2%(圖5-B)。處理C在L、M范圍內(nèi)淀粉粒數(shù)目所占百分比顯著高于CK，在R、S的淀粉粒數(shù)目所占百分比顯著低于CK。處理D在C～S直徑范圍內(nèi)淀粉粒數(shù)目所占百分比與CK差異不顯著。處理E在C～M直徑范圍內(nèi)淀粉粒數(shù)目所占百分比與處理B無顯著差異(圖5-B)。

圖5 不同授粉時期淀粉粒直徑分布Fig.5 Starch granule diameter distribution in different stages after pollination

3 討論與結(jié)論

庫容的大小會直接影響籽粒的灌漿過程進而影響產(chǎn)量，庫的減小會導致蔗糖運輸速率減弱或者庫拉力降低，因此，形成足夠的籽粒庫容是提高粒質(zhì)量的基礎(chǔ)，而庫容的大小是由籽粒中胚乳細胞數(shù)目、淀粉粒的數(shù)目和大小決定[22-24]。本研究通過探討乙烯利對庫容的影響以及搭配使用調(diào)節(jié)劑對庫容的改善情況進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CK相比乙烯利處理之后在DAP 20時百粒質(zhì)量下降約15.4%，灌漿速率下降17.7%。通過對庫容大小進行分析發(fā)現(xiàn)，乙烯利處理之后胚乳細胞數(shù)目顯著下降約22.9%，淀粉粒數(shù)目在胚乳細胞面積為1.25～2.75 μm2也顯著低于CK。另外，通過對淀粉粒的大小進行分析，發(fā)現(xiàn)淀粉粒在DAP 36，乙烯利處理組在直徑為11.49～30.21 μm的淀粉粒數(shù)目顯著低于CK，這些試驗結(jié)果表明乙烯利處理之后，顯著降低了庫容的大小。通過搭配使用不同調(diào)節(jié)劑之后發(fā)現(xiàn)，6-BA對乙烯利造成的影響恢復效果最好，乙烯利和6-BA搭配使用與CK相比胚乳細胞數(shù)目、淀粉粒數(shù)目、大小差異不顯著，這說明乙烯利與6-BA搭配使用基本可以恢復乙烯利對庫容造成的不利影響。乙烯利與1-MCP搭配使用之后，對籽粒百粒質(zhì)量、灌漿速率與乙烯利單獨使用相比有一定程度的提高，但是低于CK，并且兩者搭配使用之后胚乳細胞內(nèi)淀粉粒數(shù)目、淀粉粒大小也有一定程度的恢復，這說明1-MCP可以部分彌補乙烯利對庫容造成的不利影響。另外，乙烯利與ABA搭配使用之后，對庫容的影響與乙烯利單獨使用的差別不大，表明ABA不能恢復乙烯利對玉米庫容造成的下降。

1-MCP處理之后胚乳細胞的數(shù)目與乙烯利處理之后相比有一定程度的改善，同時胚乳細胞的面積、淀粉粒數(shù)目以及淀粉粒的直徑分布有顯著提高。這一結(jié)果與Panda等[25]研究結(jié)果有一定的相似之處。本研究結(jié)果顯示乙烯利與1-MCP的搭配使用并不能帶來胚乳細胞數(shù)目的恢復，究其原因，可能是前期乙烯利的噴施在一定程度上抑制了與細胞分裂相關(guān)的信號通路，而1-MCP的添加并未完全啟動該信號通路。然而，其內(nèi)源乙烯含量卻會下降，可能促進與淀粉相關(guān)酶類活性進而導致了淀粉合成過程的加強，在一定程度上促進了淀粉粒的積累。

6-BA對于胚乳細胞分裂的促進作用在許多研究中都有報道[26]，并且許多研究認為細胞分裂素在玉米灌漿前中期對籽粒的灌漿速率和粒質(zhì)量都有顯著的影響，并且推測6-BA可以通過增加庫容來影響產(chǎn)量[26-27]。在本研究中，胚乳細胞數(shù)目在乙烯利處理之后顯著下降，但是吐絲期噴施6-BA之后胚乳細胞數(shù)目有了顯著的提高，且與對照組差異不顯著。6-BA處理之后胚乳細胞的面積也有較大的增加，并且籽粒的灌漿速率與乙烯利處理組相比也有顯著的提高。根據(jù)以上試驗結(jié)果，推測6-BA通過增加胚乳細胞的數(shù)目以及細胞的面積擴大了庫的容積，增加了庫的拉力，進而導致籽粒灌漿速率的提高和最終產(chǎn)量的增加。

此外，乙烯與ABA對胚乳細胞程序性死亡的影響也有較多的報道[28]。玉米中胚乳細胞的程序性死亡起始于約授粉后16 d，并且乙烯參與該過程[29]。外源施加1-MCP與AVG都降低了細胞程序性死亡以及DNA的斷裂[30]，而細胞的程序性死亡過程與淀粉合成相關(guān)酶的活性直接相關(guān)。另外，本研究采用自交系B73為試驗材料，由于B73已經(jīng)完成測序工作，使用B73作為試驗材料有利于從分子生物學角度深入研究乙烯利與其他調(diào)節(jié)劑搭配使用對籽粒發(fā)育的影響，其對不同調(diào)節(jié)劑的響應與雜交種是否完全一致，還不是特別清楚。后續(xù)試驗將在探索乙烯利以及其他調(diào)節(jié)劑搭配使用對B73籽粒發(fā)育分子機制的探索以及對雜交種的影響方面展開工作。

乙烯利處理之后，B73玉米籽粒灌漿過程、胚乳細胞數(shù)目以及面積、淀粉粒徑分布、淀粉粒的大小等都受到顯著影響。乙烯利在拔節(jié)期噴施之后并在吐絲期噴施一定濃度的6-BA可以促進胚乳細胞的分裂以及淀粉粒的積累，進而增加庫容，增加灌漿速率與粒質(zhì)量。在乙烯利處理之后再施用1-MCP處理玉米，對細胞數(shù)目的變化與單獨用乙烯利處理差異不顯著，但是可以在一定程度上增加細胞的面積以及淀粉粒的數(shù)目，因而也表現(xiàn)出粒質(zhì)量與乙烯利處理組相比顯著提高的情況。在乙烯利處理之后吐絲期用ABA處理的玉米籽粒在灌漿前期表現(xiàn)出與乙烯利處理組的顯著差異，但是并沒有顯著影響籽粒的干質(zhì)量以及庫容大小。