檳榔江水牛ACBP基因克隆及分子特征、組織表達(dá)譜分析

盛 丹，劉 琴，滕曉紅，張永云，吉 麗，苗永旺

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650212)

在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，?；o酶A結(jié)合蛋白(acyl-CoA binding proteins, ACBPs)編碼基因組成一個多基因家族，該家族編碼的蛋白質(zhì)通常含有86～103個氨基酸殘基，氨基酸序列保守[1]。ACBP又稱為苯甲二氮卓結(jié)合抑制劑/地西泮結(jié)合抑制劑(Diazepam binding inhibitor, DBI)，最先在普通牛肝臟中發(fā)現(xiàn)，是一個大約10 ku受激素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，由DBI/ACBP基因編碼。該蛋白參與細(xì)胞內(nèi)脂代謝和β-咔啉以及苯二氮卓的置換，調(diào)節(jié)發(fā)生在腦突觸中A型γ-氨基丁酸受體介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[2-3]。此外，ACBP除了在腎上腺中類固醇類促腎上腺皮質(zhì)激素依賴性合成過程中起中介作用外，還介導(dǎo)胰腺分泌的反饋調(diào)節(jié)和餐后膽囊收縮素釋放[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，ACBP的同源基因廣泛存在于動物界、植物界、真菌界和原生生物界以及11個真細(xì)菌的物種中[5]。從酵母到哺乳動物ACBP都是保守的，其最保守的結(jié)構(gòu)域由7個連續(xù)的氨基酸殘基組成，構(gòu)成了中長鏈?；o酶A酯的疏水結(jié)合位點(diǎn)[6-7]。在哺乳動物細(xì)胞中，ACBP蛋白以配體結(jié)合的方式定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中[8]。在酵母菌中，ACBP能增加細(xì)胞內(nèi)?；o酶A的水平，并且在介導(dǎo)脂質(zhì)合成和膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中具有重要作用[9]。在轉(zhuǎn)基因大鼠肝臟和脂肪組織中，ACBP基因的過表達(dá)導(dǎo)致固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(Sterol regulatory element-binding protein-1, SERBP-1)和過氧化物酶體增殖劑激活受體(Peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)減少，從而影響脂肪生成[10]。

迄今，相關(guān)ACBP基因的研究主要集中在人、鼠上，在其他動物上的研究報(bào)道較少。小鼠、大鼠和人類的ACBP基因均由4個外顯子和3個內(nèi)含子區(qū)域組成，它們的ACBP基因分別定位在1號、13號和2號染色體上[11]。通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，確定普通牛ACBP基因定位于2號染色體，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，其編碼區(qū)序列全長264 bp，編碼87個氨基酸。

水牛是熱帶、亞熱帶地區(qū)的重要家畜，具有許多珍貴的生物學(xué)特性。水牛乳的主要營養(yǎng)成分顯著高于普通牛奶和人奶，是一種高檔優(yōu)質(zhì)乳[12]。檳榔江水牛(Binglangjiang water buffalo, BLJ buffalo)是在云南西部發(fā)現(xiàn)的我國第1個本土河流型水牛類群，其泌乳量高，乳品質(zhì)佳，有望培育成我國首個河流型乳用水牛新品種[13]。因此，以檳榔江水牛為研究對象，針對與乳脂代謝相關(guān)的基因開展研究，對該水牛的選育利用具有重要意義。目前，關(guān)于水牛ACBP基因的研究尚未見報(bào)道。

本研究以檳榔江水牛為研究材料，對水牛ACBP基因進(jìn)行了分離鑒定及功能生物信息學(xué)和表達(dá)譜分析，旨在揭示水牛ACBP基因的理化特性和生物學(xué)功能，為深入研究水牛乳脂代謝的遺傳基礎(chǔ)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

從云南省騰沖市采集飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致，年齡、胎次相近，無血緣關(guān)系，健康成熟的泌乳期與非泌乳期檳榔江水牛各5頭，取乳腺、腦、心臟、肝臟、肌肉、肺、小腸、腎、皺胃、脾、胰腺、脂肪、腦垂體組織，迅速置液氮中，并轉(zhuǎn)存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織總RNA提取與cDNA的合成 使用大連寶生物有限公司的RNA抽提試劑盒(RNAiso Plus, TaKaRa,中國大連)分離組織總RNA，用RNase-free水溶解產(chǎn)物后，經(jīng)紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度及完整性。使用Oligo(dT)18(500 μg/mL)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen M-MLV, TaKaRa,中國大連)合成cDNA第1鏈。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA母液稀釋為50 ng/μL的工作液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 引物設(shè)計(jì)采用NCBI數(shù)據(jù)庫中普通牛ACBP基因序列(NP_001106792)為參考序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增水牛ACBP基因完整編碼區(qū)及用于該基因表達(dá)譜分析的引物，并以18S基因序列(JN412502)設(shè)計(jì)內(nèi)參基因PCR引物，送昆明碩擎生物科技有限公司合成(表1)。

表1 引物信息Tab.1 The information of primers

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及條件 編碼區(qū)擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含2×GC Buffer 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各0.5 μL，dNTP(2.5 mmol/mL)1.25 μL，ExTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL(購自大連TaKaRa)，模板cDNA 2.5 μL(50 ng/μL)，再加ddH2O 7.5 μL補(bǔ)足25 μL體系。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 30 s，34個循環(huán)；72 ℃后延伸5 min，于4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測效果，將擴(kuò)增效果好的PCR產(chǎn)物送到昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

1.2.4.1 基因功能的生物信息學(xué)分析 采用DNAStar軟件包對所測序列進(jìn)行檢查與核對，再采用ORF finder (http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)確定ACBP基因序列的閱讀框，并進(jìn)行同源比對分析，對獲得的水牛序列進(jìn)行基因鑒定。采用ProtParam tool、ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM 2.0 和ProtComp 9.0在線程序?qū)υ摰鞍椎幕纠砘匦?、疏水結(jié)構(gòu)域、信號肽、跨膜區(qū)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測分析。利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast程序?qū)Φ鞍妆Ｊ亟Y(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測；利用NetPhos 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL在線軟件或服務(wù)器進(jìn)行蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。此外，使用ClustalX、DNAman、MegAlign以及MEGA 5.0軟件進(jìn)行各物種間的同源性分析。

1.2.4.2 組織表達(dá)差異分析 采用半定量RT-PCR方法，以水牛18S基因作為內(nèi)參對照，檢測檳榔江水牛ACBP基因在乳腺、腦、心臟、肝臟、肌肉、肺、小腸、腎、皺胃、脾、胰腺、脂肪、腦垂體13個組織的表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系與操作程序同上。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后采用Quantity One軟件對組織表達(dá)譜檢測膠圖分別進(jìn)行分析，得出相對表達(dá)量數(shù)據(jù)?；谠摂?shù)據(jù)，采用Excel軟件構(gòu)建基因表達(dá)譜柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水牛ACBP基因PCR擴(kuò)增與鑒定

采用RT-PCR法對目的基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，得到421 bp的cDNA擴(kuò)增片段(圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。通過測序獲得目的片段序列。

M. DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.水牛ACBP基因RT-PCR產(chǎn)物。M. DL2000 Marker; 1. RT-PCR product of buffalo ACBP gene.

利用ORF Finder軟件對所測序列的開放閱讀框進(jìn)行識別，發(fā)現(xiàn)該序列的CDS區(qū)長264 bp，編碼87個氨基酸(圖2)。將所得到的CDS序列采用NCBI-Blast程序進(jìn)行搜索對比，發(fā)現(xiàn)已公布的水?；蛑袥]有與本研究所獲得的目的基因CDS區(qū)序列高度相似的基因，表明ACBP基因在水牛中尚未被克隆，但該基因序列與普通牛、綿羊、馬、人和豬等物種ACBP基因有較高的同源性，故確定為水牛ACBP基因序列。將獲得的水牛ACBP基因CDS區(qū)序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得序列號：KJ463745。經(jīng)核酸組分分析，水牛ACBP基因CDS區(qū)序列的A、C、G、T堿基組成分別為37.50%，16.67%，25.38%，20.45%；G+C含量為42.05%。

2.2 水牛ACBP基本理化特征

檳榔江水牛ACBP的基本理化特征與普通牛(Bostaurus，NP_001106792)的ACBP一致性較高(表2)。檳榔江水牛ACBP理論等電點(diǎn)和相對分子質(zhì)量分別為5.85,10.04 ku，其總的親水性平均值(GRAVY)為-0.906；ACBP蛋白第80位氨基酸殘基處有最大親水值(-2)，在第25位氨基酸殘基處有最小親水值(0.333)；該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為32.15。以上揭示水牛ACBP為親水的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

ATG.起始密碼子；*.終止密碼子；陰影部分表示ACBP保守結(jié)構(gòu)域。ATG.Start codon; *. Stop codon; The shaded area represents ACBP conserved domain.

表2 檳榔江水牛ACBP的基本理化特征Tab.2 Basic physicochemical characteristics of Binglangjiang buffalo ACBP

2.3 水牛ACBP的磷酸化位點(diǎn)

使用NetPhos 2.0在線軟件預(yù)測檳榔江水牛ACBP的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白有4個磷酸化位點(diǎn)(表3)。

表3 檳榔江水牛ACBP磷酸化位點(diǎn)Tab.3 The phosphorylated sites of Binglangjiang buffalo ACBP

2.4 水牛ACBP的細(xì)胞定位與結(jié)構(gòu)特征

亞細(xì)胞定位分析表明，檳榔江水牛ACBP定位于細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能(可能性為96%)，該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)、無信號肽，含有一個ACBP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是ACBP超家族的成員特有的。

檳榔江水牛ACBP的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(Alpha helix)、β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)、延伸片段(Extended strand)和無規(guī)則卷曲(Random coli)組成(圖3)，其中47個氨基酸組成α-螺旋、7個氨基酸組成β-轉(zhuǎn)角、10個氨基酸組成延伸片段和23個氨基酸組成無規(guī)則卷曲，所占比例分別為54.02%，8.05%，11.49%和26.44%。水牛ACBP二級結(jié)構(gòu)與普通牛的二級結(jié)構(gòu)相似度較高(包含52.87%的α-螺旋、8.05%的β-轉(zhuǎn)角、11.49%的延伸片段、27.59%的無規(guī)則卷曲)。根據(jù)同源建模方法預(yù)測的檳榔江水牛ACBP三維結(jié)構(gòu)如圖4所示。檳榔江水牛ACBP與普通牛ACBP模板(1hb8.1.A)的序列一致性高達(dá)98.84%。

預(yù)測的ACBP蛋白二級結(jié)構(gòu)在其氨基酸序列下方用單個字母表示:h.α螺旋；e.延伸鏈；t.β-轉(zhuǎn)角；c.無規(guī)則卷曲。The predicted ACBP protein secondary structure is shown in single letter below the amino acid sequence:h. Alpha helix; e. Extended strand; t. Beta turn; c. Random coil.

圖4 檳榔江水牛ACBP三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Putative tertiary structural of Binglangjiang buffalo ACBP

2.5 ACBP氨基酸序列同源性及聚類分析

將檳榔江水牛ACBP氨基酸序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast同源比對搜索，得到以下常見物種的同源序列：普通牛(NP_001106792)、牦牛(XP_005896385)、山羊(XP_005676309)、綿羊(XP_004004799)、馬(XP_001487927)、人(NP_001073331)和豬(NP_999284)。水牛與上述物種的ACBP氨基酸序列一致性分別為98.9%，97.7%，97.7%，98.9%，90.8%，92.0%和92.0%(表4)。結(jié)果表明，水牛與其他?？莆锓N的ACBP氨基酸序列非常保守。在水牛與普通牛之間僅發(fā)現(xiàn)了1個氨基酸差異，即p.Q15H；而在水牛與牦牛之間卻發(fā)現(xiàn)2個氨基酸差異，即p.Q15H和p.T18P?；谝陨衔锓N氨基酸序列，構(gòu)建檳榔江水牛及其他7個物種間的NJ-系統(tǒng)樹，以揭示各物種間的進(jìn)化關(guān)系和物種間ACBP功能上的相似性。結(jié)果表明，水牛與牛科物種聚在一起，且具有較高的支持率(圖5)。

表4 水牛與其他物種ACBP氨基酸序列的一致性Tab.4 Identity of ACBP amino acid sequence between buffalo and other species %

注：對角線上方數(shù)值表示序列一致性，對角線下方數(shù)值表示序列分歧度。

Note: Data above the diagonal line represent the percent identify and below the diagonal line represent the sequential divergence.

圖5 ACBP氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the ACBP amino acid sequences

2.6 ACBP基因組織差異表達(dá)分析

采用半定量RT-PCR方法，以18SrRNA為內(nèi)參，檢測ACBP基因在成年檳榔江水牛13個組織中的表達(dá)差異。在非泌乳期成年水牛中，ACBP基因在瘤胃、心臟、脾臟中表達(dá)量較高；在腎臟、垂體、大腦、脂肪、皮膚和肌肉中表達(dá)量較低；在肝臟、肺臟、小腸和乳腺中幾乎不表達(dá)。在泌乳階段成年水牛中，該基因在心臟、瘤胃和大腦中表達(dá)量較高；在小腸、乳腺、垂體和脂肪中表達(dá)量適中；在肝臟、脾臟、腎臟、皮膚和肌肉中表達(dá)量較低；肺臟中幾乎不表達(dá)(圖6)。

3 討論

本研究通過電子克隆的方法分離得到水牛ACBP基因的編碼區(qū)全序列。通過同源比對分析確定為水牛ACBP基因的序列。檳榔江水牛該基因編碼區(qū)序列長為264 bp，與普通牛ACBP基因編碼區(qū)序列長度相同。該基因編碼一個由87個氨基酸組成的多肽，其蛋白相對分子量為10.04 ku，理論等電點(diǎn)為5.85，與已研究的其他動物的ACBP相類似。生物信息學(xué)分析表明，水牛ACBP為親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽，定位于細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用；在結(jié)構(gòu)上，水牛ACBP含有一個ACBP保守結(jié)構(gòu)域，其二級結(jié)構(gòu)與普通牛一致性較高；其三維結(jié)構(gòu)與普通牛ACBP模板(1hb8.1.A)的序列一致性高達(dá)98.84%。經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，水牛與普通牛、綿羊的ACBP序列一致性為98.9%，水牛與山羊、牦牛的ACBP序列一致性為97.7%。物種間序列比對也表明，ACBP序列具有高度保守性，這與以往的報(bào)道相一致[6]，進(jìn)一步揭示了該蛋白功能上的重要性。在構(gòu)建的系統(tǒng)樹上，水牛與普通牛、綿羊、山羊和牦牛聚在一起，表明水牛ACBP的功能與?？莆锓N較接近。以上進(jìn)一步確認(rèn)本研究所分離的基因?yàn)樗CBP基因，水牛該基因編碼的蛋白質(zhì)與普通牛及其他物種的ACBP的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征一致性高，揭示水牛與其他物種ACBP的功能具有一致性。

18S rRNA表達(dá)作為內(nèi)參；M.DL2000 DNA Marker；1.心臟；2.肝臟；3.脾臟；4.肺；5.腎；6.瘤胃；7.小腸；8.垂體；9.大腦；10.乳腺；11.脂肪；12.皮膚；13.肌肉。圖中未標(biāo)字母及標(biāo)有相同字母的為差異不顯著(P>0.05),標(biāo)有不同字母者為差異顯著或極顯著(小寫字母表示P<0.05,大寫字母表示P<0.01)。

ACBP基因編碼產(chǎn)物為?；o酶A結(jié)合蛋白，其通常以1∶1的化學(xué)計(jì)量高親和性地結(jié)合飽和與不飽和的C14-C22酰基輔酶A脂[14]。長鏈?；o酶A酯是脂肪合成和脂肪酸降解過程中的重要中間體，同時(shí)，其在調(diào)節(jié)中間代謝和基因表達(dá)方面也有重要作用[1]。長鏈?；o酶A酯是一種兩親性分子，在較低的濃度下可以分化成磷脂雙層結(jié)構(gòu)，抑制大量的細(xì)胞功能和酶活性[1]。長鏈?；o酶A酯在發(fā)揮功能作用時(shí)需要維持一定量的酰基輔酶A與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相結(jié)合，以便在需要酰基輔酶A時(shí)快速調(diào)用[1]。在真核細(xì)胞中起這種作用的主要蛋白因子就是ACBP[1]。因此，ACBP蛋白參與了許多細(xì)胞內(nèi)的過程包括脂肪酸、甘油和甘油磷脂的生物合成、β-氧化、細(xì)胞分化和增殖以及眾多的酶活性的調(diào)節(jié)，以及在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與脂質(zhì)代謝途徑中起著重要作用[15]。ACBP含有一個ACBP超家族的成員特有的高度保守的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含對?；o酶A高親和力的功能位點(diǎn)[7]。近年研究顯示，普通牛ACBP對長鏈?；o酶A酯表現(xiàn)出高親和力，推測其在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)長鏈?；o酶A酯的運(yùn)輸和儲存[16]；在泌乳期奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，ACBP在細(xì)胞內(nèi)?；o酶A的運(yùn)輸過程中發(fā)揮特殊作用[17]；酵母ACBP的同源蛋白Acb1p是正常脂肪酸鏈的延伸、鞘脂的合成和囊泡運(yùn)輸?shù)冗^程中所必需的，在細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮特殊作用[18]；人的ACBP通過調(diào)節(jié)膽固醇生物合成起始步驟所必需的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶1(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase1, HMGCS1)和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGCR)而影響膽固醇的合成[19-20]；斷奶期小鼠的肝臟中，ACBP的缺乏導(dǎo)致白色脂肪組織(White adipose tissue, WAT)脂解作用升高，肝臟脂肪堆積，以及SREBP(Sterol regulatory element binding protein)基因的延遲感應(yīng)[21]。本研究結(jié)果顯示，水牛的ACBP在氨基酸序列及結(jié)構(gòu)上與哺乳動物一致性較高，所含的ACBP結(jié)構(gòu)域在物種間是高度保守的。這表明水牛的ACBP在功能上與人、普通牛等極為相似，推測其可能參與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝、長鏈?；o酶A運(yùn)輸、膽固醇合成等過程。

在哺乳動物中，ACBP基因的表達(dá)量在不同細(xì)胞類型之間顯著不同[14]。在哺乳動物細(xì)胞中，ACBP基因高表達(dá)于代謝活性高的組織中，比如肝臟、脂肪組織、皮膚、外分泌腺等[22]。在小鼠中，該基因在脂肪細(xì)胞及涉及運(yùn)輸功能的上皮細(xì)胞中表達(dá)量較高，而在肺、肌肉和脾臟等組織中的表達(dá)量較低[23]。在奶山羊乳腺組織中，ACBP基因的表達(dá)量在泌乳期顯著高于非泌乳期[24]。本研究表明，在非泌乳期，水牛ACBP基因在心臟、脾臟、腎、瘤胃、垂體、大腦、脂肪、皮膚、肌肉中表達(dá)，其中瘤胃、心臟、脾臟中表達(dá)量較高；在泌乳期，該基因在心臟、肝臟、脾臟、腎、瘤胃、小腸、垂體、大腦、乳腺、脂肪、皮膚、肌肉中均表達(dá)，其高表達(dá)于瘤胃、大腦、心臟中。2個時(shí)期相比，ACBP基因的表達(dá)量在瘤胃、小腸、心臟、肝臟、垂體、大腦、乳腺、脂肪、皮膚、肌肉組織中差異較大，推測與該基因在這些組織的功能狀態(tài)差異有關(guān)。此外，該基因在泌乳期乳腺、小腸、肝臟中表達(dá)，而在非泌乳期這些組織中不表達(dá)，表明該基因在泌乳期這些組織中發(fā)揮重要作用，推測該基因的表達(dá)可能與泌乳期乳脂代謝過程相關(guān)聯(lián)。