39份外引小麥種質(zhì)抗病基因的分子標(biāo)記檢測及其抗病性評價

董 娜，陳向東，胡鐵柱，李 淦，張亞娟，茹振鋼

(河南科技學(xué)院 小麥中心，河南省高等學(xué)校作物分子育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

小麥(TriticumaestivumL.)是重要的糧食作物，其產(chǎn)量約占糧食作物總產(chǎn)量的1/5，是我國人民糧食供給的主體[1]。由于生長周期長，小麥在生長過程中極易受到各種病害的威脅，其中由專性寄生真菌條形柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf. sp.tritici)和禾本科布氏白粉菌(Erysiphegraminisf. sp.tritici)引起的小麥條銹病和小麥白粉病是影響小麥生產(chǎn)的2種重要常發(fā)病害，在各麥區(qū)廣泛分布，嚴(yán)重影響小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)[2]。近年來，隨著冬季干旱少雨、氣溫偏高，春季多雨、氣溫回升快等極端天氣不斷出現(xiàn)，小麥生產(chǎn)上傳統(tǒng)常發(fā)病害的發(fā)生程度有加重趨勢。

病害防治是小麥生產(chǎn)中一項長期而艱巨的任務(wù)。實(shí)踐證明，培育和推廣抗病品種是控制小麥病害最經(jīng)濟(jì)、有效和安全的途徑。迄今，國際上正式命名的主效抗條銹病基因有79個，即Yr1～Yr79[3-4]；正式命名的抗白粉病基因包括44個位點(diǎn)上的60多個基因或等位基因(http://wheat.pw.usda.gov/)[5]，其中一部分已經(jīng)被轉(zhuǎn)育到栽培品種中[6]。由于小麥抗條銹病基因和抗白粉病基因具有很強(qiáng)的小種?；?，生產(chǎn)上應(yīng)用的抗病基因很容易因?yàn)椴≡玖︻l率變化或新的毒力型的出現(xiàn)而喪失抗性[7-9]。因此，合理利用已發(fā)現(xiàn)的抗病基因,尋找有效新抗源，拓寬小麥品種抗性遺傳多樣性，是我國小麥抗病育種研究的當(dāng)務(wù)之急和長遠(yuǎn)任務(wù)。

外引種質(zhì)為我國小麥抗病育種提供了重要的基因資源。例如,以尤皮1號、尤皮2號、維爾和洛夫林10號作為我國不同地區(qū)重要的條銹病抗源,曾育成了一系列生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的抗銹品種[10]。周新力等[11]對80份國外春小麥種質(zhì)資源的抗條銹性評價表明，這些資源中大部分對我國小麥條銹菌流行小種表現(xiàn)優(yōu)良的抗病性；李艷麗等[12]對從美國引進(jìn)的67份小麥材料進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查及條銹病、白粉病、赤霉病的抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，67份材料含有豐富的條銹病和白粉病的抗性基因，其中有5份材料綜合抗病性好，17份材料兼抗2種病害；伍玲等[13]利用分子標(biāo)記對273份CIMMYT小麥材料進(jìn)行抗病基因Lr34/Yr18/Pm38檢測，其中43份含有上述基因，在不同地點(diǎn)對條銹病、葉銹病和白粉病具有不同程度的抗病性；丁曉義等[14]從165份CIMMYT小麥材料中篩選出白粉病免疫材料9份，高抗材料3份，這些材料抗病性表現(xiàn)穩(wěn)定，可用作抗白粉病育種雜交親本。總之，外引種質(zhì)中優(yōu)異抗病基因的挖掘與利用，對拓寬我國小麥遺傳資源、提高小麥生產(chǎn)品種抗病基因多樣性、促進(jìn)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)新品種培育具有重要意義。為此，對河南科技學(xué)院小麥中心保存的39份外引小麥種質(zhì)中抗條銹病、白粉病基因進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，并對其進(jìn)行抗病性評價，以期為小麥抗病育種親本選擇和種質(zhì)資源的合理利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 小麥材料的種植

39份小麥種質(zhì)分別引自澳大利亞、智利、墨西哥、美國等10個國家，由河南科技學(xué)院小麥中心收集和保存。所有小麥種質(zhì)均種植于新鄉(xiāng)市輝縣的種質(zhì)圃中，每份種質(zhì)播種2行，畦埂上種誘發(fā)行(石家莊8號)，常規(guī)田間管理，第2年春季小麥返青后取樣檢測。

1.2 小麥抗病性的調(diào)查

白粉病為田間自然發(fā)病，于小麥灌漿中期調(diào)查不同品種白粉病的發(fā)病情況，病級劃分采用0～4級法。0級：免疫，植株全株無病斑，無菌絲體附著；0;級：發(fā)生過敏性壞死反應(yīng)，葉片有枯死斑；1級：高抗，病斑很小，菌絲層稀薄、可見綠色葉面，偶有較大病斑，但仍透綠，產(chǎn)孢量極少；2級：中抗，葉片病斑小，菌絲層較厚但立體感較弱，不透綠，能產(chǎn)生一定量孢子；3級：中感，葉片病斑多，菌絲層厚、立體感強(qiáng)，葉片失綠，產(chǎn)孢量大，但病斑不連片；4級：高感，葉片病斑很多，菌絲層厚，產(chǎn)孢量多，病斑連片。

條銹病采用接種誘發(fā)，條銹病菌為生產(chǎn)上流行小種的混合菌株，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，于小麥拔節(jié)期(3月中下旬)，采用孢子懸液注射法進(jìn)行接種，每行接種1個分蘗，灌漿初期調(diào)查條銹病發(fā)病情況，病級劃分采用0～4級法。0(免疫型)：葉上無可見癥狀；0；(近免疫型)：葉上產(chǎn)生小枯斑，無孢子堆；1(高抗型)：夏孢子堆小，周圍有枯斑；2(中抗型)：夏孢子堆小到中等大小，生在綠色組織上，周圍有枯斑；3(中感型)：夏孢子堆較大，周圍組織有褪綠現(xiàn)象；4(高感型)：夏孢子堆大，周圍不褪綠。

1.3 基因組DNA的提取及分子標(biāo)記檢測

取小麥幼苗葉片約0.2 g放入1.5 mL離心管中，液氮研磨后，采用CTAB法提取基因組DNA[15]，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果。

本研究選用目前生產(chǎn)上抗性較好且已開發(fā)分子標(biāo)記的抗條銹病基因Yr5、Yr10、Yr18和抗白粉病基因Pm4、Pm13、Pm21進(jìn)行分子標(biāo)記檢測。分子標(biāo)記引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，序列見表1。PCR擴(kuò)增于ABI Gene Amp PCR System 9700型PCR儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，包括2×TaqMaster Mix(購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)10 μL，10 μmol/L上、下游特異引物各0.5 μL，模板DNA 50～100 ng，其余用ddH2O補(bǔ)足。SCAR1400的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，36個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。SCAR564、STS470、SC200和csLV34的擴(kuò)增程序均為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，36個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。S1320的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，36個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。S1320的擴(kuò)增產(chǎn)物于170 V下用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳約2 h，經(jīng)銀染和顯影后，利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并拍照保存；其他標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物均于110 V下用1%瓊脂糖凝膠(含goldview染料)電泳約40 min，然后用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并拍照保存。

表1 抗病基因、分子標(biāo)記及其引物序列Tab.1 Disease-resistant genes, markers and their sequences used in this research

2 結(jié)果與分析

2.1 39份外引小麥種質(zhì)中Yr5基因的分子標(biāo)記檢測

利用與Yr5基因共分離的SCAR標(biāo)記S1320檢測該基因在39份外引小麥種質(zhì)中的分布情況，含有Yr5基因的種質(zhì)可擴(kuò)增出156 bp的目標(biāo)條帶。在檢測的39份種質(zhì)中有21份能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA條帶，說明這21份種質(zhì)含有Yr5基因；其他18份種質(zhì)均未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，說明這些種質(zhì)不含Yr5基因，檢出率為53.85%(圖1)。

M.100 bp Marker；1-31.部分檢測樣品；P.陽性對照。M.100 bp DNA Ladder; 1-31.Partial samples detected; P.Positive control.

2.2 39份外引小麥種質(zhì)中 Yr10基因的分子標(biāo)記檢測

利用SCAR標(biāo)記SC200對39份外引小麥種質(zhì)Yr10基因進(jìn)行檢測，該標(biāo)記與Yr10的遺傳距離為0.5 cM，含有Yr10基因的種質(zhì)可擴(kuò)增出200 bp的目標(biāo)條帶。在檢測的39份種質(zhì)中有2份能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的目標(biāo)條帶，說明這2份種質(zhì)含有Yr10基因；其他37份種質(zhì)均沒有擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，說明這些種質(zhì)不含Yr10基因，檢出率為5.13%(圖2)。

M.DL2000 Marker；1-24.部分檢測樣品。圖3-4同。M.DL2000 DNA Ladder; 1-24.Partial samples detected.The same as Fig.3-4.

2.3 39份外引小麥種質(zhì)中 Yr18基因的分子標(biāo)記檢測

利用STS標(biāo)記csLV34對39份外引小麥種質(zhì)Yr18基因進(jìn)行檢測，該標(biāo)記與Yr18的遺傳距離為0.4 cM，含有Yr18基因的種質(zhì)可擴(kuò)增出150 bp的目標(biāo)條帶。在檢測的39份種質(zhì)中有6份能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的目標(biāo)條帶，說明這6份種質(zhì)含有Yr18基因；其他33份種質(zhì)均沒有擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，說明這些種質(zhì)不含Yr18基因，檢出率為15.38%(圖3)。

圖3 外引小麥種質(zhì)中Yr18基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.3 Molecular detection of stripe rust resistance gene Yr18 in introduced wheat germplasms

2.4 39份外引小麥種質(zhì)中 Pm4基因的分子標(biāo)記檢測

利用與Pm4基因共分離的標(biāo)記STS470檢測該基因在39份外引小麥種質(zhì)中的分布情況，含Pm4基因的種質(zhì)可擴(kuò)增出470 bp的目標(biāo)條帶。在檢測的39份種質(zhì)中有7份能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的目標(biāo)條帶，說明這7份種質(zhì)中含有Pm4基因；其他32份種質(zhì)均沒有擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，說明這些種質(zhì)不含Pm4基因，檢出率為17.95%(圖4)。

圖4 外引小麥種質(zhì)中Pm4基因的分子標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.4 Molecular detection of powdery mildew resistance gene Pm4 in introduced wheat germplasms

2.5 39份外引小麥種質(zhì)中Pm13和Pm21基因的分子標(biāo)記檢測

利用共分離標(biāo)記SCAR564和SCAR1400分別對39份外引小麥種質(zhì)Pm13基因和Pm21基因進(jìn)行分子檢測，含Pm13基因的種質(zhì)可以擴(kuò)增出大小為564 bp的目標(biāo)條帶，含Pm21基因的種質(zhì)可以擴(kuò)增出大小為1 400 bp的目標(biāo)條帶。本試驗(yàn)檢測的39份種質(zhì)中均未擴(kuò)增出上述2個基因的目標(biāo)條帶，說明這些種質(zhì)均不攜帶抗白粉病基因Pm13和Pm21。

2.6 39份外引小麥種質(zhì)中抗病基因的分布情況及其抗病性評價

由表2可知，在39份外引小麥種質(zhì)中，攜帶Yr5基因的有21份，攜帶Yr10基因的有2份，攜帶Yr18基因的有6份。其中，澳阿優(yōu)1號、HUAYUN、TAMOI和CMT-3(T88)同時攜帶Yr5和Yr18基因，意大利白麥同時攜帶Yr5和Yr10基因。從抗條銹性鑒定結(jié)果看，Yr18基因抗性穩(wěn)定，單獨(dú)存在及與Yr5聚合均表現(xiàn)良好抗性。Yr5基因在不同遺傳背景中抗性表現(xiàn)不一致，與Yr18聚合時，表現(xiàn)近免疫至中抗，其余17份種質(zhì)中，有6份表現(xiàn)近免疫至中抗，11份表現(xiàn)中至高感。攜帶Yr10基因的2份種質(zhì)中，1份表現(xiàn)中抗，另1份表現(xiàn)高感。另有7份種質(zhì)KPL-1、攀道拉、CL0401、09智引3號、墨特大、墨176和MRYC，雖未檢測到上述3個抗條銹病基因，但是具有良好的條銹病抗性，表現(xiàn)中至高抗，后續(xù)將進(jìn)一步分析其條銹病抗性基因。

在39份外引小麥種質(zhì)中，均未檢測到抗白粉病基因Pm13和Pm21，有7份種質(zhì)攜帶Pm4基因。白粉病抗性鑒定結(jié)果顯示，Pm4基因基本喪失白粉病抗性，攜帶該基因的7份種質(zhì)中僅有1份抗病，其余6份表現(xiàn)感病。另有4份種質(zhì)澳阿優(yōu)1號、法國材料、莫斯科39和非黑土地24，雖未檢測到上述3個抗白粉病基因，但是具有良好的白粉病抗性，后續(xù)將進(jìn)一步分析其抗白粉病基因。

此外，澳阿優(yōu)1號和bermude綜合抗病性好，同時具有條銹病和白粉病抗性，在育種過程中可以合理利用。

表2 39份外引小麥種質(zhì)攜帶抗病基因情況及其抗病性Tab.2 Disease resistant genes carried in these wheat germplasms and the degree of their disease resistance

3 結(jié)論與討論

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，已開發(fā)出可用于目標(biāo)基因檢測的多種分子標(biāo)記如STS、SCAR、CAPS、RGAP、SSR等，與抗病基因共分離或緊密連鎖的分子標(biāo)記可準(zhǔn)確、快速地鑒定抗病基因的組成和數(shù)目。為了初步明確河南科技學(xué)院小麥中心收集的39份外引小麥種質(zhì)中條銹病和白粉病抗性基因組成，本研究對目前生產(chǎn)上抗性較好且已開發(fā)分子標(biāo)記的抗條銹病基因Yr5、Yr10、Yr18和抗白粉病基因Pm4、Pm13、和Pm21進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測，同時結(jié)合田間鑒定，對外引種質(zhì)的抗病性進(jìn)行評價。

本研究檢測Yr18基因用的是與其緊密連鎖的STS標(biāo)記csLV34，該標(biāo)記在輔助育種中已有較多應(yīng)用。楊文雄等[22]利用csLV34對慢銹基因Lr34/Yr18進(jìn)行分子檢測，從231份小麥育成品種(系)和422份農(nóng)家品種中分別鑒定出14份和359份種質(zhì)具有上述基因。白小軍等[23]利用該標(biāo)記從111份寧夏小麥材料中鑒定出20份材料攜帶慢銹基因Lr34/Yr18，成株期條銹病抗性鑒定結(jié)果表明，含有Lr34/Yr18基因的材料對條銹病具有較好的抗性。本研究從39份外引小麥種質(zhì)中鑒定出攜帶Yr18基因的種質(zhì)6份，對條銹病菌表現(xiàn)近免疫至中抗，抗性表現(xiàn)穩(wěn)定，進(jìn)一步驗(yàn)證了該標(biāo)記重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高。

Yr5和Yr10為全生育期抗條銹病基因，對目前生產(chǎn)上的流行小種CYR32、CYR33具有良好抗性[9]。本研究分別利用與Yr5、Yr10連鎖的SCAR標(biāo)記S1320、SC200對其進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記陽性的種質(zhì)抗病性表現(xiàn)并不一致，標(biāo)記S1320陽性的21份種質(zhì)中10份表現(xiàn)近免疫至中抗，其余11份表現(xiàn)中至高感；標(biāo)記SC200陽性的2份種質(zhì)中，1份表現(xiàn)中抗，1份表現(xiàn)高感，可能與載體品種的遺傳背景有關(guān)，前人研究中有過類似報道[24-25]。韓德俊等[24]利用緊密連鎖的分子標(biāo)記STS7/8對小麥種質(zhì)中的Yr5基因進(jìn)行檢測，有15份種質(zhì)對該標(biāo)記呈陽性反應(yīng)，但其抗病性表現(xiàn)與Yr5單基因系都不相符。因此，認(rèn)為所篩選的抗源可能都不具有Yr5基因。王樹和等[25]用SCAR標(biāo)記Yr10F/R對Yr10基因進(jìn)行檢測，9份該標(biāo)記陽性的種質(zhì)中只有3份表現(xiàn)抗病，另外6份不具有Yr10基因的抗性表現(xiàn)。另外，本研究利用的分子標(biāo)記SC200與Yr10基因位點(diǎn)之間仍有0.5 cM的遺傳距離，會發(fā)生一定頻率的重組。因此，利用這些分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種時，要結(jié)合接種鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

檢測抗白粉病基因Pm13、Pm21用的是與其共分離的標(biāo)記SCAR564、SCAR1400，其在輔助育種中已有較多應(yīng)用。河南科技學(xué)院小麥中心也曾用這2個標(biāo)記開展過分子標(biāo)記輔助育種[26-27]，標(biāo)記穩(wěn)定可靠。因此，可以確定本研究中39份種質(zhì)均未擴(kuò)增出上述標(biāo)記的目標(biāo)條帶是由于這些種質(zhì)中均未攜帶這2個基因。Pm4基因基本喪失白粉病抗性，攜帶該基因的7份種質(zhì)中有1份抗病，可能與該種質(zhì)遺傳背景有關(guān)，也可能是因?yàn)樵摲N質(zhì)含有其他白粉病抗性基因。