左旋多巴原料藥精制母液化學(xué)成分的研究

黃 艷， 趙小超， 李學(xué)堅*， 盧文杰， 蘇彩珍， 柴 玲， 劉布鳴

（1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西 南寧530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實驗中心，廣西 南寧530222；3.廣西邦爾藥業(yè)有限公司，廣西 百色531599）

左旋多巴，即（-） -3-（3，4-基苯基） -L-丙氨酸，具有顯著的抗帕金森綜合癥作用，收載于2015 年版《中國藥典》［1］、 《歐洲藥典》［2］等；生產(chǎn)工藝有化學(xué)合成法、植物提取法、微生物轉(zhuǎn)化法及新興的代謝轉(zhuǎn)化法［3］；國內(nèi)以植物提取法為主，生產(chǎn)原料以貓豆為主。歐洲藥典記載的相關(guān)物質(zhì)（雜質(zhì)） 有（2 s） -2-amino-3-（2，4，5-trihydroxy phenyl）propionic acid、3-methoxy-l-tyrosine、3-methoxy-dl-tyrosine、D-dopa。從以貓豆為原料生產(chǎn)的左旋多巴原料藥產(chǎn)品中可檢出3-methoxy-l-tyrosine、3-methoxy-dl-tyrosine。在生產(chǎn)實踐中，雖然產(chǎn)品質(zhì)量達到《歐洲藥典》 要求，但HPLC 圖譜上仍會出現(xiàn)近10 個未知成分的雜質(zhì)峰，有時歐洲市場會以某種雜質(zhì)峰過高為由拒絕購買或重新議價。為了弄清這些未知的化學(xué)成分，課題組對左旋多巴原料藥生產(chǎn)工藝的精制母液進行研究，從中分離出12個化合物，且所有化合物均為首次從該母液中獲得。

1 材料

Bruker Dre-600 MHz 核磁共振儀（德國Bruker公司）；Waters2545-2767-2489 高壓制備液相色譜儀（美國Waters 公司）；分析型液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Autospec Premier 776 質(zhì)譜儀（美國Waters 公司）；XS205 電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器）；HH-S 恒溫水浴鍋 （江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；ZWD-83-1 型電熱熔點檢測器（江蘇沙頭文教五金塑料廠）； DZF-6050 真空干燥箱、 DHG9 246 A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；KQ5200B 超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。柱色譜、薄層色譜用硅膠（青島海洋化工廠）。色譜儀用化學(xué)試劑為色譜純， 其余為分析純。

精制母液由廣西邦爾藥業(yè)有限公司提供，對應(yīng)的左旋多巴原料藥產(chǎn)品批號20160517。

2 提取與分離

精制母液用4%NaOH 水溶液調(diào)至pH 6.0，低溫真空濃縮成稠膏，60 ℃真空干燥，得干膏5.28 kg，打粉，用95%乙醇回流提取3 次 （12、8、8 倍量），冷至室溫，濾過，合并提取液，減壓回收乙醇，干燥，得醇提膏250.81 g。醇提膏用1 500 mL蒸餾水混懸， 依次用1 000 mL 石油醚 （60 ～90 ℃）、1 000 mL 乙酸乙酯、1 000 mL 正丁醇各萃取2 次，合并萃取液，減壓回收溶劑，干燥，得相應(yīng)部位35.88、53.95、87.82 g。石油醚部位經(jīng)硅膠柱（石油醚-乙酸乙酯100 ∶0 ～1 ∶1）、Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1 ∶1）、重結(jié)晶以及制備液相等分離得化合物1（62.95 mg）、2（46.94 mg）、3（100.21 mg）、4（32.83 mg）、5（18.11 mg）、6（62.28 mg）、7（49.92 mg）、8（68.32 mg）；乙酸乙酯部位經(jīng)硅膠柱（氯仿-甲醇100 ∶0 ～1 ∶1）、Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1 ∶1）、制備液相等分離得化合物9（15.73 mg）；正丁醇部位經(jīng)D101 型吸附樹脂、G-25 凝膠柱（甲醇-水100 ∶0 ～4 ∶1）、制備液相分離純化得化合物10（27.34 mg）、11（24.47 mg）、12（15.89 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色針狀結(jié)晶（氯仿-甲醇），EIMS m／z：412［M］＋。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：5.35（1H，d，J ＝3.9 Hz，H-6），5.14（1H，q，J ＝24.6 Hz，H-22），5.03（1H，q，J ＝21.9 Hz，H-23），3.50（1H， s，-OH），1.02 （3H， s， H-21）， 0.99 （3H， s， H-19）， 0.85 （6H， s， H-26、H-27）， 0.82 （3H， s， H-29）， 0.69 （3H，s，H-18）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz） δ：37.3（C-1），31.9（C-2），71.8（C-3），42.3（C-4），140.7（C-5）， 121.7 （C-6）， 31.9 （C-7、 8），50.1（C-9），36.5 （C-10），21.2 （C-11），39.7（C-12），42.2（C-13），56.9 （C-14），24.3 （C-15），29.0（C-16），56.0（C-17），11.9（C-18），19.4 （C-19）， 40.5 （C-20）， 21.1 （C-21），138.3 （C-22）， 129.3 （C-23）， 51.3 （C-24），31.7（C-25），21.1（C-26），19.0（C-27），25.4（C-28），12.1（C-29）。以上數(shù)據(jù)與文獻［4］ 基本一致，故鑒定為豆甾醇。

化合物2： 白色蠟狀結(jié)晶， EI-MS m／z：256［M］＋。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：2.36（2H，t，J ＝7.5 Hz，H-2），1.63（2H，m，H-15），1.25（br，s），0.88（3H， t， J ＝7.0 Hz， CH3）；13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：180.3 （C-1），34.1（C-2）， 24.7 （C-3）， 29.1 ～29.7 （C-4 ～13），31.9（C-14），22.7（C-15），14.1（C-16）。以上數(shù)據(jù)與文獻［5］ 基本一致，故鑒定為棕櫚酸。

化合物3： 無色片狀結(jié)晶 （石油醚-乙酸乙酯）， EI-MS m／z： 420 ［ M-H2O］＋。1H-NMR（CDCl3， 500 MHz） δ： 3.58 （2H， t， J ＝7.5 Hz，-CH2OH）， 1.53 （2H， m， H-2、 3）， 1.21（54H， m， CH2）， 0.84 （3H， t， J ＝5.0 Hz，CH3）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：62.7 （C-1），32.6（C-2），14.0（C-30），22.6 ～31.8（C-29～3）。以上數(shù)據(jù)與文獻［6］ 基本一致，故鑒定為正三十烷醇。

化合物4：無色片狀結(jié)晶（氯仿），EI-MS m／z：358［M］＋。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δ：4.21（1H，dq，J ＝4.5 Hz，H-1′b），4.16（1H， dq，J ＝5.5 Hz，H-1′a），3.93（1H，m，H-2′），3.68（2H，m，H-3′），2.36 （2H，t，J ＝8.1 Hz，H-2），1.63（2H，m，H-3），1.24 ～1.32（28H，m，H-4～17），0.86（3H，t，J ＝5.9 Hz，H-18）；13CNMR（CDCl3，125 MHz） δ：174.4 （C-1），14.0（C-18），70.3 （C-1′），65.2 （C-2′），63.3 （C-3′），22.7～34.2（C-17 ～2）。以上數(shù)據(jù)與與文獻［7］ 基本一致， 故鑒定為十八酸-2， 3-二羥基丙酯。

化合物5： 無色針狀結(jié)晶 （石油醚-乙酸乙酯），EI-MS m／z：458［M］＋。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：4.51（1H，d，J ＝10 Hz，H-22），5.33（1H， s， H-12）， 3.70 （2H， m， H-24）， 3.65（1H， m， H-3）， 1.24 （3H， s， H-23）， 1.14（3H， s， H-25）， 1.06 （3H， s， H-26）， 1.04（3H， s， H-27）， 0.96 （3H， s， H-28）， 0.94（3H，s，H-29），0.85（3H，s，H-30）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz） δ：38.1（C-1），25.8（C-2），80.2（C-3）， 42.3 （C-4）， 56.3 （C-5）， 19.1（C-6），33.4（C-7），39.0（C-8），48.2（C-9），36.1 （C-10）， 23.7 （C-11）， 122.4 （C-12），144.8 （C-13）， 42.4 （C-14）， 28.4 （C-15），26.5（C-16），37.0（C-17），45.3（C-18），46.8（C-19），30.0（C-20），42.4 （C-21），75.6 （C-22），23.6（C-23），64.6（C-24），16.3（C-25），17.1（C-26），25.8（C-27），28.7（C-28），33.5（C-29），21.2（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］ 基本一致，故鑒定為soyasapogrnol B。

化合物6：無色針狀結(jié)晶（氯仿-甲醇），進行溴甲酚綠反應(yīng)呈陽性，即有羧基的存在。EI-MS m／z：284［M］＋， 185 ［ （CH2）10COOH］、 129［（CH2）6COOH］、73［（CH2）2COOH］ 呈現(xiàn)飽和脂肪酸的特征裂解，碎片離子峰在257 之后均相差1 個14（CH2） 質(zhì)量單位，為直碳鏈的特征裂解方式。1H-NMR（Pyr-d5，500 MHz） δ：0.86（3H，t，J ＝5 Hz， H-18），1.28 （28H， br，-CH2），1.78（2H， m， H-3），2.52 （2H， t， J ＝7.5 Hz， H-2）；13C-NMR（Pyr-d5，125 MHz） δ： 176.0 （C-1），14.3（C-18），22.9 ～34.9（C-17 ～2）。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］ 基本一致，故鑒定為硬脂酸。

化 合 物7： 無 色 油 狀 物， EI-MS m／z： 282［M］＋。1H-NMR（Pyr-d5，500 MHz）δ：5.43 ～5.46（4H，m，H-9、10、12、13），2.54（2H，m，H-11）， 2.48 （2H， t， J ＝6.0 Hz， H-2）， 2.07（2H， m， H-14）， 2.06 （2H， m， H-8）， 1.74（2H， m， H-3），0.85 （3H， t， J ＝5.9 Hz， H-18）， 1.25 ～1.384 （14H， m， CH2）；13C-NMR（Pyr-d5，125 MHz） δ：176.2 （C-1），34.9 （C-2）， 25.7 （C-3）， 29.5 （C-4）， 29.5 （C-5），29.7（C-6）， 29.4 （C-7）， 25.7 （C-8）， 130.2（C-9），135.3（C-10），25.6（C-11），135.5（C-12）， 123.8 （C-13）， 27.6 （C-14）， 32.2 （C-15），32.1（C-16），30.1（C-17），14.3（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［10］ 基本一致，故鑒定為亞油酸。

化合物8： 無色針狀結(jié)晶， EI-MS m／z：428［M］＋，397（100），基峰與離子分子峰相差1 個O2符合麥角醇的裂解規(guī)律。1H-NMR（Pyr-d5，500 MHz）δ：5.16 （1H， dd， J ＝13.2，6.5 Hz， H-23），5.19（1H，dd，J ＝13.1，5.9 Hz，H-22），6.52（1H，d，J ＝13.5 Hz，H-7），6.31（1H，d，J ＝8.5 Hz， H-6）， 4.31 （1H， m， H-3）， 1.09（3H，s，H-19），0.96（3H，d，J ＝15.0 Hz，H-21）， 0.90 （3H， d， J ＝3.8 Hz， H-28）， 0.85（3H，d，J ＝3.8 Hz，H-27），0.82（3H，d，J ＝3.8 Hz，H-26），0.81 （3H， s， H-18）；13C-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：35.5（C-1），31.3（C-2），65.9（C-3）， 37.5 （C-4）， 82.3 （C-5）， 135.4（C-6），131.0（C-7），79.3（C-8），52.0（C-9），37.5（C-10），23.7（C-11），39.6（C-12），44.7（C-13），52.0（C-14），20.2 （C-15），29.1 （C-16），56.3（C-17），13.0（C-18），19.9（C-19），39.6 （C-20）， 21.1 （C-21）， 135.4 （C-22），132.3 （C-23）， 43.1 （C-24）， 33.3 （C-25），20.2（C-26），18.4（C-27），17.9（C-28）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］ 基本一致，故鑒定為5α，8α-環(huán)二氧-（22E，24R） -麥角甾-6，22-二烯-3β-醇。

化合物9： 白色片狀結(jié)晶， EI-MS m／z：154［M］＋。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.28（1H，d，J ＝3.1 Hz，H-4），6.76（1H，d，J ＝3.2 Hz，H-2），6.61（1H，d，J ＝8.6 Hz，H-6）；13C-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：120.3（C-1），117.4（C-2），149.8（C-3），155.6（C-4），117.0 （C-5），121.3（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］ 報道基本一致，故鑒定為原兒茶酸。

化合物10：無色針狀結(jié)晶，EI-MS m／z：223［M］＋。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.60（1H，s， H-7）， 6.59 （1H， s， H-4）， 4.49 （1H， q，J ＝6.9 Hz，H-1），3.93（1H，dd，J ＝11.1，5.7 Hz，H-2），3.21 （1H， dd， J ＝16.9，11.5 Hz，H-3），2.97（1H，dd，J ＝10.7，16.8 Hz，H-3），1.59 （3H， d， J ＝ 6.9 Hz， H-10）；13C-NMR（CD3OD，125 MHz） δ：53.3 （C-1），51.8 （C-2），30.1 （C-3），123.3 （C-4），146.6（C-5），146.0 （C-6）， 125.7 （C-7）， 115.9 （C-8），113.7（C-9），20.4 （C-10），173.6 （C-11）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］ 基本一致，故鑒定6，7-dihydroxy-1-methyl-1，2，3，4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboylic acid。

化合物11：無色針狀結(jié)晶，EI-MS m／z：299［M］＋。1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δ：3.03（2H，d，J ＝7.5 Hz， H-3），3.12 （1H， d， J ＝711.3 Hz，H-12），3.87 （1H， d， J ＝16.8 Hz， H-2），4.55（1H，m，H-1），6.23（1H，s，H-5），6.55（1H，s，H-8），7.37（2H，s，H-13、13′），7.38（2H， s， H-14、14′），2.03 （1H， s， NH）；13CNMR（CD3OD，125 MHz） δ：58.4（C-1），49.5（C-2），30.8 （C-3），125.2 （C-4），113.6（C-5），145.8（C-6），146.5（C-7），116.2 （C-8），125.2 （C-9）， 41.2 （C-10）， 172.9 （C-11），145.8（C-12）， 128.5 （C-13）， 130.1 （C-14），125.2（C-15）。以上數(shù)據(jù)與文獻［14］ 基本一致，故鑒定為6，7-dihydroxy-1-benzyl-1，2，3，4-tetrahydro-isoquinoline-3-carboylic acid。

化合物12：無色針狀結(jié)晶，EI-MS m／z：165［M］＋。1H-NMR（CD3OD，500 MHz） δ：7.25（2H，d，J ＝7.0 Hz，H-2′、6′），7.35（2H，m，H-3′、5′），7.30 （1H， d， J ＝6.7 Hz， H-4′）， 3.78（1H， dd， J ＝9.0，4.7 Hz， H-2），3.29 （1H，dd，J ＝2.2，4.9 Hz，H-3a），3.01（1H，dd，J ＝14.6，5.6 Hz， H-3b）；13C-NMR （CD3OD， 125 MHz）δ：173.7 （C-1），57.6 （C-2），38.2 （C-3）， 137.3 （C-1′）， 130.4 （C-2′、 6′）， 129.2（C-3′、 5′）， 128.4 （C-4′）。 以 上 數(shù) 據(jù) 與 文 獻［15］ 基本一致，故鑒定為苯丙氨酸。

4 相關(guān)物質(zhì)檢測

參照《歐洲藥典》 方法［2］，將化合物1～12 和左旋多巴原料藥溶液分別注入高效液相色譜儀，未見有相同時間的出峰。

分別制訂所有化合物TLC 展開條件，然后取化合物和左旋多巴原料藥產(chǎn)品分別點樣，在該化合物的展開系統(tǒng)中展開，未出現(xiàn)相同位置的斑點。

5 討論

貓豆主要含有左旋多巴、貓豆胍等成分［16-17］，但因左旋多巴有顯著的抗帕金森綜合癥活性，因此與貓豆相關(guān)的研究，大多與左旋多巴相關(guān)。以貓豆為原料生產(chǎn)左旋多巴的工藝中沒有化學(xué)合成工序，不會產(chǎn)生新化合物，課題組從精制母液中分離得到的12 個化合物，溯其根源，也是貓豆的化學(xué)成分。

采用HPLC 和TLC 方法進行檢測，均未在左旋多巴產(chǎn)品中檢出12 個化合物，表明這些化合物不殘留于左旋多巴原料藥產(chǎn)品中，即應(yīng)與左旋多巴原料藥的相關(guān)物質(zhì)無關(guān)。