生鮮乳中微生物檢測技術(shù)研究進(jìn)展

趙艷坤，陳賀，王帥，王富蘭，蔡建星，王成

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（烏魯木齊），新疆農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室，烏魯木齊 830091）

隨著人們對高水平生活的向往和追求，乳品的需求量不斷增加，人們對乳品的關(guān)注不止在于其豐富的營養(yǎng)價值，更傾向于乳品質(zhì)量安全問題。生鮮乳作為乳制品的源頭，其全價的營養(yǎng)成分為微生物提供了理想的生長繁殖條件，有害微生物的污染成了優(yōu)質(zhì)生鮮乳的最大危害，這不僅影響乳品質(zhì)量安全，也關(guān)乎著整體乳業(yè)的健康發(fā)展。因此，對生鮮乳中微生物進(jìn)行安全、高效、便捷的檢測對奶業(yè)綠色發(fā)展及人類健康具有重要意義。

1 微生物學(xué)檢測技術(shù)現(xiàn)狀

多年來，多數(shù)企業(yè)、乳品產(chǎn)商及質(zhì)檢部門采用傳統(tǒng)方法檢測乳品中微生物，主要對普通活菌總數(shù)進(jìn)行測定，包括標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)（Standard plate count method，SPC）和顯微鏡直接觀察（Direct microscopic observation，DMC）兩種方法。傳統(tǒng)檢測方法雖具有所需設(shè)備簡單易操作和低成本的優(yōu)點(diǎn)，但多依賴操作人員的主觀判斷能力，并不能完全鑒定出乳品中某些細(xì)菌[1]，數(shù)據(jù)的可靠性及結(jié)論的正確性難以保證，且操作過程繁瑣、周期長、費(fèi)時費(fèi)力，無法滿足大批量檢測和處理突發(fā)事件的需要。為實現(xiàn)快速檢測目的，有研究者建立了皿膜系統(tǒng)、疏水網(wǎng)格濾膜（Hydrophobic grid mesh filter，HGMF）法、螺旋板系統(tǒng)等，這些優(yōu)化的檢測方法均一定程度上提高了操作效率，尤其是HGMF法能濾去樣品中的抑制因子，使其在轉(zhuǎn)移過程中不需進(jìn)行懸浮處理，避免了菌體受到物理破壞，可對沙門氏菌、大腸菌群、霉菌及酵母菌計數(shù)，在生鮮乳和巴氏殺菌乳的質(zhì)量管理中被廣泛應(yīng)用[2]。

2 物理生化技術(shù)

2.1 電阻抗法

微生物在培養(yǎng)基中生長繁殖時，可將培養(yǎng)基中的碳水化合物、蛋白質(zhì)、糖、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)新陳代謝為氨基酸、乳酸等小分子物質(zhì)，這個過程使培養(yǎng)基的導(dǎo)電性能增強(qiáng)而電阻抗性降低，因此可通過測定培養(yǎng)前后培養(yǎng)基的電阻抗變化情況來判定微生物數(shù)量和生長等[3]。目前，電阻抗法在食品微生物快速檢測中已較為普遍，但在生鮮乳中的應(yīng)用研究還較少。Bancalari等[4]利用電阻抗法測量電導(dǎo)率變化來追蹤牛奶中微生物的生長情況，結(jié)果顯示阻抗的擬合曲線與細(xì)菌生長曲線高度一致，說明電阻抗法完全適用于牛奶中微生物的檢測。國內(nèi)早有學(xué)者證明了電阻抗方法檢測牛奶中細(xì)菌總數(shù)的可行性，較傳統(tǒng)檢測方法，可大大縮短檢測周期。近年來，杜寒春等[5]建立了電阻抗法快速測定牛乳中菌落總數(shù)的方法，檢測限為101～107cfu/mL，得到的阻抗檢測時間與菌落總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.5923t+9.4172，相關(guān)系數(shù)r=-0.9907，可信度高。

與直接滴定（GB）法相比，電阻抗法簡便易操作、耗時短、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且適用于不同時期、不同來源、不同酸度的產(chǎn)品，實用性更強(qiáng)，但其靈敏度易受樣品菌落總數(shù)濃度影響，檢測時間和檢測限不一定精準(zhǔn)。另外，由于國內(nèi)阻抗儀器質(zhì)量尚有待改進(jìn)，其成本偏高，該方法目前尚未普及于生鮮乳中微生物檢測的應(yīng)用。

2.2 快速測試片法

快速測試片法是指以紙片、紙膜和膠片等作為培養(yǎng)基載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在上面，通過微生物在上面的生長特征和顯色反應(yīng)來測定乳品中微生物的方法[6]。研究報道，一種適用于檢測乳品中大腸桿菌的快速試紙片，最低檢出限達(dá)到4cfu/mL，檢測結(jié)果與GB法相比符合率高于96%[7]。美國3M公司研發(fā)的Petrifilm測試片是一種商品化較成熟的菌落測試片，因其自身配有培養(yǎng)基，待測樣品則不需增菌，準(zhǔn)確性高，在乳品微生物現(xiàn)場檢測中具有很大優(yōu)勢，且能夠區(qū)分大腸菌群中的大腸桿菌和其他成員[8]。梁春梅等[9]使用快速測試片法對生鮮乳、酸奶、純牛奶等樣品進(jìn)行菌落總數(shù)測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)快速測試片的準(zhǔn)確性、特異性、靈敏度、穩(wěn)定性等各項指標(biāo)與國標(biāo)方法（GB4789.2-2010）檢測結(jié)果差異不顯著，具有高度一致性，可提高乳制品中菌落總數(shù)的檢測效率。

該檢測方法簡便易行，費(fèi)用低，適合現(xiàn)場采樣檢測，可在短時間內(nèi)迅速對樣品進(jìn)行初篩，但由于空間有限，會因受細(xì)菌代謝產(chǎn)物的影響和待測樣品中復(fù)雜成分的干擾，使菌落之間相互粘連，導(dǎo)致計數(shù)不準(zhǔn)。

2.3 三磷酸腺苷（ATP）生物發(fā)光技術(shù)

ATP濃度能夠反映存在的活體微生物數(shù)量[10]。Niksic等[11]將該法與GB法進(jìn)行比較，證明了二者具有高度相關(guān)性。在國外，ATP技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于乳品工業(yè)，如生鮮乳活菌數(shù)檢測、UHT乳活菌數(shù)檢測等[12]。國內(nèi)學(xué)者也對此技術(shù)有了較成熟的探究，如：陸燁等[13]通過ATP生物熒光技術(shù)快速測定細(xì)菌總數(shù)的實驗，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌等三種細(xì)菌的檢出菌數(shù)對數(shù)值與ATP值的對數(shù)值之間呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.961；王慧榮等[14]采用改進(jìn)的ATP生物發(fā)光技術(shù)快速測定活菌量，結(jié)果表明ATP檢測限為0.001nM，活菌ATP濃度與平板計數(shù)的菌落總數(shù)結(jié)果差異不顯著，具有一定線性相關(guān)性。雖然此方法有操作簡單、檢測快速、范圍廣、攜帶方便、可在線檢測、檢出率高等優(yōu)點(diǎn)，但仍存在不能分辨非微生物中含有的ATP缺陷，會因生鮮乳等新鮮樣品中含有大量游離ATP和體細(xì)胞而導(dǎo)致檢出限較低，同時易受鹽等成分的干擾。

3 免疫學(xué)技術(shù)

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA的基本原理是將抗原或抗體作為試劑用酶進(jìn)行標(biāo)記，將其固定于固相載體表面，保持其免疫原性，在載體上將酶染色后通過酶催化底物使其生成有顏色的產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與樣品中待檢物質(zhì)的量成一定比例，通過測量產(chǎn)物的量對待檢樣進(jìn)行定性和定量。ELISA能夠?qū)崿F(xiàn)大批量樣品的同時檢測（96孔），檢測限一般在105cfu/mL。王文彬[15]報道稱對于食源性致病菌等大分子的微生物，一般采用雙抗體夾心ELISA進(jìn)行檢測，靈敏度高且檢測數(shù)據(jù)可靠。國外對食源性致病菌免疫檢測方法的研究已較為成熟，其中ELISA檢測方法受到廣泛關(guān)注。最新研究發(fā)現(xiàn)，通過建立一種高靈敏度、特異性的ELISA系統(tǒng)，能夠用于檢測牛奶、肉類和大米中的金黃色葡萄球菌，得出ELISA可用于微生物菌群的免疫檢測的結(jié)論[16]；Arenas等[17]利用ELISA對16家采用不同抗生素的畜牧場奶牛中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌造成的食物污染進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有75%的農(nóng)場受到這些食源性致病菌的污染。

綜上，ELISA用于檢測乳制品等各種樣品中食源性致病菌的通用性較好，在保證檢測準(zhǔn)確性的前提下，與其他方法相比，ELISA具有方便快捷、低成本的優(yōu)點(diǎn)，但抗體的特異性、抗原與抗體的濃度和反應(yīng)液會影響檢測結(jié)果，當(dāng)檢測污染較嚴(yán)重的樣品時，會受到其他細(xì)菌的影響而降低其檢測特異性。因此，此方法適用于企業(yè)、基層檢驗機(jī)構(gòu)等有關(guān)食品中食源性致病菌的檢測。

3.2 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique，IFT）

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique，IFT）也稱熒光抗體技術(shù)，主要原理是用熒光素標(biāo)記抗體，然后與待檢樣品中的抗體特異性結(jié)合，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與待測物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，根據(jù)計算得到待測樣品含量。IFT作為一種新型檢測技術(shù)，除用于檢測大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等食品致病菌，還可被用于沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特氏菌等多種致病菌的檢測[6]。雖然IFT檢測時間短、效率高、靈敏度高，但是抗體價格較貴，成本高，技術(shù)性程序較復(fù)雜，易發(fā)生交叉感染，出現(xiàn)假陽性，難以進(jìn)行大規(guī)模普及使用，目前，IFT在乳制品行業(yè)的應(yīng)用報道較少，有待進(jìn)一步探究。

4 分子生物學(xué)技術(shù)

4.1 PCR技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是能使微生物在體外迅速擴(kuò)增特異目標(biāo)基因的一種技術(shù)。此技術(shù)無需培養(yǎng)，直接取樣檢測，快速、靈敏，可以大大縮短檢測時間，尤其是對于食品中存在較少且規(guī)定不得檢出的致病菌具有獨(dú)特的優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的微生物監(jiān)測。由于其可以將低濃度微生物進(jìn)行大量擴(kuò)增，因此增加了微量濃度微生物被檢出的可能性，但是檢測之前需要知道待檢微生物的核酸序列，對于未知核酸序列的微生物較為局限，定量檢測能力稍差，如果和熒光定量相結(jié)合則較完美。閆晗等[18]建立了多重PCR檢測方法，實現(xiàn)了對乳品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的同時檢測，較國標(biāo)方法縮短了12～24h。研究表明，熒光定量PCR技術(shù)不僅可以檢測出多種細(xì)菌，且能準(zhǔn)確鑒定出它們的種和亞種間的基因序列，以此為辨別它們的親緣關(guān)系[19]。劉艷艷[18]采用熒光定量PCR法對500份鮮乳樣品中細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測，實現(xiàn)了對生鮮乳中污染細(xì)菌種類的鑒定，并建立了污染細(xì)菌譜，進(jìn)一步對100份生鮮乳樣品同時運(yùn)用國標(biāo)法和熒光定量PCR法檢測，驗證了PCR法檢測細(xì)菌的準(zhǔn)確性在90%以上，檢測時間在4 h左右，得出結(jié)論：熒光定量PCR是一種快速檢測鮮乳細(xì)菌總數(shù)的新方法，能夠為生鮮乳樣品的質(zhì)量等級進(jìn)行快速的確定。Sartori報道指出美國乳品科學(xué)協(xié)會最新開發(fā)了一種對牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測方法，發(fā)現(xiàn)RT-qPCR能夠快速檢測出靶細(xì)菌，相比于國標(biāo)法，檢測特異性敏感性為100%，且能夠準(zhǔn)確排除其他基因型和細(xì)菌種類，排他性達(dá)98%，揭示了RT-qPCR作為一種檢測微生物的新途徑，能夠簡單明了對目的細(xì)菌進(jìn)行檢測，非常適用于乳品等各種樣品的常規(guī)微生物檢測[20]。

4.2 核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是在堿基配對的基礎(chǔ)上使用核苷酸探針與靶基因特異性進(jìn)行生物測定的一種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號，能從龐大的基因組中顯示出目的基因是一段帶有檢測標(biāo)記，且有順序已知的與目的基因互補(bǔ)的核酸序列（DNA或RNA）[21]。

核酸雜交技術(shù)中使用較廣泛的是熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），F(xiàn)ISH通過熒光素標(biāo)記探針并進(jìn)行雜交，對雜交點(diǎn)進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測定便可得到特定核苷酸序列及其含量。Barrero等[22]利用FISH技術(shù)對大腸桿菌基因進(jìn)行特異性檢測，結(jié)果不到6h，其靶基因和rRNA基因即被檢測出，充分顯示了其檢測效率。核酸雜交技術(shù)正是由于熒光物質(zhì)的使用提高了分辨率，確保了足夠的靈敏度和特異性，操作簡便，能夠快速檢測出待測樣品中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等微生物的成分及含量，但遺憾的是每檢測一種微生物就需要一種探針，成本較高，難以對待測樣品中多種污染菌實現(xiàn)一次性或連續(xù)性檢測，應(yīng)用范圍有限。

4.3 基因芯片技術(shù)

近年來，基因芯片技術(shù)是發(fā)展迅速的一項高新技術(shù)，現(xiàn)階段在各個領(lǐng)域被各國學(xué)者高度重視，成為時下研究熱點(diǎn)，已有大量研究工作及成果，但仍有部分問題需進(jìn)一步探討?；蛐酒夹g(shù)是將設(shè)計好的基因片段或寡核苷酸單鏈序列固定于芯片上，形成二維DNA探針陣列，待檢微生物DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增后形成熒光標(biāo)記分子，再與芯片上的寡核苷酸點(diǎn)進(jìn)行雜交，然后通過熒光波長掃描儀定量分析待檢樣品中是否含有目標(biāo)微生物及其含量。目前，已廣泛應(yīng)用于各種食品微生物檢測。最新研究報道稱，基因芯片還可用于測定乳品中藥物殘留?；蛐酒夹g(shù)具有速度快、精準(zhǔn)度高的優(yōu)點(diǎn)，能夠檢出待測樣品中可能存在的多種微生物成分和致病菌，甚至可識別死菌的DNA，但此方法需一定專業(yè)技術(shù)且難度較大，目前在我國乳品安全檢測技術(shù)中尚未形成一定的應(yīng)用規(guī)模。

4.4 流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry, FCM）是以激光做為光源，通過檢測光散射信號和熒光信號強(qiáng)度，推測出微生物的大小、形狀和數(shù)量。FCM曾在第二次世界大戰(zhàn)中用于細(xì)菌和孢子的檢測，隨著儀器光學(xué)系統(tǒng)的改進(jìn)及新熒光素的發(fā)現(xiàn)，近年來，F(xiàn)CM在微生物學(xué)的應(yīng)用發(fā)展迅速。研究報道，F(xiàn)CM能夠鑒定食品中微生物的活性，可快速鑒別并計算死/活細(xì)胞數(shù)目，由此可以評價食品的殺菌效果及有益菌的含量[23]。有研究證實，F(xiàn)CM可檢測生鮮乳等食品中致病菌含量，且FCM計數(shù)的檢測時間僅為1h[24]，能夠滿足批量樣品在線檢測需求，較平板計數(shù)法大大縮短了檢測用時，此外，F(xiàn)CM的靈敏度更高、更準(zhǔn)確。近期，國外研究者發(fā)現(xiàn)FCM技術(shù)可用于金黃色葡萄球菌等致病菌的檢測，為某些疾病的診斷提供一種快速有效的檢測方法[25]。楊莉婷等[26]建立了FCM快速檢測并計算生鮮乳中細(xì)菌總數(shù)的方法，與國標(biāo)檢測方法相比，相關(guān)性分析顯示兩者呈直線相關(guān)（r=0.9802），極顯著相關(guān)（P＜0.01），檢出限為101cfu/mL，證明了FCM技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度；另外，Langerhuus等[27]利用FCM技術(shù)對乳房炎乳中革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FCM可快速識別乳樣中的革蘭氏陰性菌，靈敏度為1，特異性為0.74，為由革蘭氏陰性菌引起的乳房炎抗菌治療提供了一種新途徑。然而，F(xiàn)CM仍有一些弊端，如使用成本過高，只能檢測液態(tài)樣品，且由于對待測液體樣品有比較嚴(yán)格的要求，任何與目標(biāo)物粒徑相近的微粒都可能影響檢測結(jié)果，而生鮮乳中的蛋白質(zhì)顆粒、脂肪球、體細(xì)胞等成分會干擾FCM對目標(biāo)物的篩選及確認(rèn)，因此，F(xiàn)CM技術(shù)在生鮮乳微生物檢測方面的主要問題是清除這三種干擾成分。

5 展望

隨著現(xiàn)階段乳制品工業(yè)的迅速發(fā)展及乳品質(zhì)量安全意識的普遍提高，傳統(tǒng)的微生物檢測方法已不能滿足需求，在現(xiàn)代發(fā)達(dá)的科學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上，建立和完善安全、高效的微生物檢測方法對確保生鮮乳質(zhì)量安全及促進(jìn)乳品工業(yè)科技進(jìn)步具有重大意義。綜上所述，近年來國內(nèi)外開發(fā)了多種微生物安全檢測技術(shù)方法，今后在乳品業(yè)有著非常廣闊的應(yīng)用前景?？傮w分析可知，這些方法相比于傳統(tǒng)方法，雖解決了檢測時間問題，但在檢測敏感性、特異性及操作等方面各有利弊，因此為了提高生鮮乳微生物檢測率，確保乳品質(zhì)量安全，現(xiàn)實檢測過程中常將多種方法結(jié)合使用。此外，不難發(fā)現(xiàn)，這些新型檢測技術(shù)的成本較高，這也是其不能成為各機(jī)構(gòu)和基層實驗室普遍使用的檢測方法的重要原因之一，但是生鮮乳的質(zhì)量關(guān)乎著乳品安全，與消費(fèi)者的健康和生命安全息息相關(guān)，所以，筆者呼吁我國乳品安全檢測相關(guān)部門有必要加強(qiáng)對生鮮乳微生物安全檢測技術(shù)的投入力度，為乳品安全創(chuàng)造一個良好的環(huán)境氛圍。同時，為了能真正實現(xiàn)準(zhǔn)確性好、靈敏度高、低成本和快速的微生物智能檢測，我們?nèi)孕璨粩嗫朔嶋H應(yīng)用中遇到的困難和挑戰(zhàn)，加強(qiáng)研究力度和深度。