奶牛早期妊娠診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

陳超，張欣欣，安志高，胡祥維，華麗萍，李可可，楊利國(guó)

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070）

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和生活水平的不斷提高，人們對(duì)于乳制品的需求量越來(lái)越大，要求也越來(lái)越高，這也對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提出了更高的要求，所以為了滿足社會(huì)發(fā)展的需要，需不斷推進(jìn)奶牛養(yǎng)殖的現(xiàn)代化和科學(xué)化。經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的發(fā)展，中國(guó)奶牛產(chǎn)業(yè)已經(jīng)從傳統(tǒng)、落后、粗放的養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變成規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化、精細(xì)化、產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖的模式，很多先進(jìn)技術(shù)也得到了大力的推廣[1]，其中早期妊娠診斷技術(shù)在近些年也得到了快速的發(fā)展。

早期妊娠診斷技術(shù)在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中一直扮演著重要的角色，特別是在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中。母牛在配種后應(yīng)盡早地確定是否妊娠，這對(duì)于保胎、減少空懷、提高母畜的繁殖力是非常重要的[2]。經(jīng)過(guò)早期妊娠診斷，對(duì)于確定懷孕的母牛，盡早提供妊娠母牛所需要的營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，能夠保證胎兒的正常發(fā)育，避免胚胎的早期死亡或流產(chǎn)；對(duì)于未妊娠的母牛，找出原因后及時(shí)采取措施進(jìn)行二次配種，對(duì)于多次配種不孕的母牛及時(shí)淘汰，通過(guò)縮短產(chǎn)犢間隔而達(dá)到提高母牛繁殖效率的目的。簡(jiǎn)便有效的妊娠診斷方法，尤其是早期妊娠的診斷方法，能夠大大提高母畜的繁殖效率。母畜繁殖效率一直是畜牧生產(chǎn)中極為重視的問(wèn)題，繁殖效率的提高能大大提高畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。早期妊娠診斷的準(zhǔn)確性也是至關(guān)重要的，如果發(fā)生妊娠診斷錯(cuò)誤，將會(huì)造成發(fā)情母畜的失配和已妊娠母畜的誤配，從而人為地延長(zhǎng)產(chǎn)犢間隔，影響經(jīng)濟(jì)效益。

近年來(lái)，研究人員針對(duì)奶牛的早期妊娠診斷技術(shù)進(jìn)行了諸多研究，以期找到一種快速、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的臨床方法對(duì)奶牛早期妊娠情況進(jìn)行診斷。

1 早期妊娠診斷的直接方法

早期妊娠診斷的直接方法是通過(guò)手動(dòng)或借助電子儀器直接對(duì)母畜進(jìn)行檢測(cè)的過(guò)程。直腸觸診法和超聲波診斷法是目前用于早期診斷妊娠的兩種主要直接方法。直接方法的優(yōu)點(diǎn)在于能夠直接在動(dòng)物個(gè)體上進(jìn)行操作，操作過(guò)程比較簡(jiǎn)單，得出結(jié)果迅速。缺點(diǎn)是該方法需要有足夠的生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)與技術(shù)專長(zhǎng)才能保證診斷的準(zhǔn)確性。有研究報(bào)道，操作者的熟練程度以及授精后的技術(shù)執(zhí)行階段會(huì)影響檢測(cè)的特異性和靈敏度，有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員可以用這兩種方法獲得高靈敏度和特異性[3]。

1.1 直腸觸診

經(jīng)直腸觸診子宮用于牛的妊娠診斷最早始于19世紀(jì)，是最早且最廣泛應(yīng)用于奶牛早期妊娠診斷的直接方法。盡管隨著早期妊娠診斷技術(shù)的發(fā)展，妊娠診斷的方法也不再單一，但直腸觸診法仍然是技術(shù)人員選擇妊娠診斷的常用方法，主要是由于它不需要在實(shí)驗(yàn)室中操作和復(fù)雜的設(shè)備，而且可以快速得出結(jié)果。通過(guò)直腸觸診法進(jìn)行妊娠診斷是基于檢測(cè)到妊娠的四種陽(yáng)性標(biāo)志中的至少一種：羊膜、羊膜囊泡、胎盤組織和胎兒[4]。直腸觸診在奶牛生產(chǎn)中不僅僅用于妊娠診斷，還可以用于相關(guān)繁殖疾病的檢查。梁國(guó)鵬等[5]研究證明直腸觸診能有效用于母牛卵巢以及繁殖疾病的診斷。

在一些研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)直腸觸診檢查妊娠早期的母牛會(huì)增加醫(yī)源性流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[6,7]，而有另外一些研究報(bào)道，妊娠母牛經(jīng)直腸羊囊膜觸診對(duì)于隨后的妊娠流產(chǎn)沒(méi)有影響[8]。盡管關(guān)于經(jīng)直腸觸診引起母牛的醫(yī)源性流產(chǎn)的程度仍存在爭(zhēng)議，但由于其使用的廣泛性，以及進(jìn)行直腸觸診檢查的技術(shù)工作者都是經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的，有著豐富的實(shí)踐生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，加上直腸觸診具有較高的準(zhǔn)確性和低成本等優(yōu)點(diǎn)，所以經(jīng)直腸觸診仍然是奶牛妊娠診斷的常用方法。

1.2 超聲波檢查

超聲診斷起源于20世紀(jì)40年代，50年代初期A型超聲診斷法首先應(yīng)用于臨床，不久B型和D型超聲診斷法相繼問(wèn)世。70年代B型速成法興起，80年代初脈沖多普勒D型超聲法試用成功[9]。近年來(lái)，隨著超聲波技術(shù)的發(fā)展，畜牧生產(chǎn)中對(duì)該技術(shù)的需求也日益增加，尤其是在牛的妊娠診斷方面。利用該方法診斷的常用儀器主要有A超、B超以及D超（多普勒超聲）儀，其中多普勒超聲和B超儀在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用比較廣泛。隨著B超和D超的發(fā)展，A超在早期妊娠診斷中的應(yīng)用逐漸減少。超聲波檢查法相對(duì)于直腸觸診法來(lái)說(shuō)，其優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確性高，對(duì)母牛和胚胎無(wú)損傷等，缺點(diǎn)是操作需借助儀器，成本較高等。

B超進(jìn)行早期妊娠診斷具有快速、直觀、準(zhǔn)確、無(wú)損傷等優(yōu)點(diǎn)[10]，近年來(lái)在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，技術(shù)也越來(lái)越成熟，大大提高了奶牛的繁殖效率以及奶牛養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效益。賈國(guó)慧等[11]用B超技術(shù)對(duì)126頭奶牛進(jìn)行妊娠診斷，26～28d的診斷準(zhǔn)確率為90.48%，29～31d、32～60d的診斷準(zhǔn)確率均為100%。鄧干臻[12]等對(duì)137頭黑白花奶牛進(jìn)行配種后，在26～30d進(jìn)行妊娠檢查，確診率高達(dá)88.9%，高于50日齡左右的直腸檢查準(zhǔn)確率；配種后31～35d時(shí)的確診率為97.2%，配種后35d以上的確診率達(dá)到100%。以上數(shù)據(jù)均表明利用B超技術(shù)能夠在母牛妊娠早期進(jìn)行較為準(zhǔn)確的診斷。B超除了在早期妊娠診斷上得到廣泛應(yīng)用外，還用于胎兒性別鑒定、生殖疾病檢查等方面[13]，在動(dòng)物生產(chǎn)中有著重要意義。

D型超聲波是利用多普勒效應(yīng)原理，對(duì)運(yùn)動(dòng)的臟器和血流進(jìn)行檢測(cè)的儀器，多普勒D型儀可通過(guò)測(cè)定母畜和胎兒血流量及胎動(dòng)周期診斷是否妊娠。多普勒超聲檢查具有高性能、多功能、高分辨率、高清晰度等特點(diǎn)，診斷準(zhǔn)確度高。但目前由于D型超聲波儀器造價(jià)高以及操作等方面的問(wèn)題導(dǎo)致D超在畜牧業(yè)的應(yīng)用較少，但在人類各種疾病的檢查中廣泛使用。

2 早期妊娠診斷的間接方法

早期妊娠診斷的間接方法是使用母體體液中的一些激素等特異性物質(zhì)的定性或定量測(cè)定值作為母畜妊娠的指標(biāo)。間接方法的優(yōu)點(diǎn)主要在于可同時(shí)進(jìn)行大批量的妊娠診斷并且不用直接接觸母畜；缺點(diǎn)在于需要借助一些儀器并且前期需要進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)來(lái)確定妊娠陽(yáng)性指標(biāo)。間接方法的研究主要是為了能夠進(jìn)行商業(yè)化大批量早期妊娠診斷，提高診斷效率，減少人工和成本消耗，增加企業(yè)收益。

2.1 孕酮檢測(cè)

黃體酮是生物活性最強(qiáng)的孕激素，主要在母牛發(fā)情周期和妊娠期胎盤期間由黃體產(chǎn)生和分泌。使用放射免疫測(cè)定（RIA）或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法可以在實(shí)驗(yàn)室中對(duì)血液或牛奶中的黃體酮進(jìn)行定量[3]。1959年Yalow首次創(chuàng)立了RIA，由于RIA靈敏度和精確度高，重復(fù)性好，其應(yīng)用日益廣泛。1971年英國(guó)的Laing等首次將RIA用于牛乳中孕酮(P4)的測(cè)定，并首次證明了乳中P4濃度所反映的發(fā)情周期階段與直接卵巢的評(píng)估結(jié)果相一致[14]。Hoffmann等為排除乳脂率對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，1976年建立了乳脂孕酮測(cè)定的方法[15]。

丁紅[16]等用RIA方法測(cè)定703頭配種后21～24d母牛乳中孕酮含量，通過(guò)研究，確定乳脂孕酮的判斷值大于1.0ng/10μL為妊娠，小于0.8ng/10μL為未妊娠，0.8～1.0ng/10μL為可疑；利用乳脂孕酮值判別為妊娠的準(zhǔn)確率為88.6%，未妊娠的準(zhǔn)確率為97.4%。吳凌[17]等利用自建的奶牛乳汁孕酮競(jìng)爭(zhēng)ELISA法(酶標(biāo)抗原法)研發(fā)了奶牛乳汁孕酮ELISA試劑盒，應(yīng)用該試劑盒檢測(cè)乳汁孕酮診斷奶牛妊娠與未妊娠的準(zhǔn)確率分別為93.3%和95.8%。

2.2 妊娠相關(guān)糖蛋白（PAG）檢測(cè)

牛PAG是對(duì)奶牛進(jìn)行間接早期妊娠診斷的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的。分子克隆和測(cè)序研究表明，PAG屬于家養(yǎng)反芻動(dòng)物胎盤表達(dá)的一大類非活動(dòng)性天冬氨酸蛋白酶，在牛中，PAG基因家族至少包含22個(gè)轉(zhuǎn)錄基因以及一些變異體[18]。牛PAG已經(jīng)被免疫定位于胎兒子葉絨毛中存在的滋養(yǎng)層雙核細(xì)胞，并從滋養(yǎng)外胚層向子宮上皮的雙核細(xì)胞遷移，允許含有顆粒的具有胞吐作用的PAG進(jìn)入母體循環(huán)[19]。

李艷艷等[20]用牛妊娠相關(guān)糖蛋白ELISA試劑盒檢測(cè)配種后28～45d的273頭荷斯坦牛血清中PAG的含量來(lái)進(jìn)行妊娠診斷，并與75d直腸妊娠檢查結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛PAG ELISA早孕檢測(cè)試劑盒妊娠診斷的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確性分別為100%、75.5%、86.5%、100%和90.5%，證明妊娠相關(guān)糖蛋白試劑盒可以準(zhǔn)確診斷出空懷奶牛，可用于奶牛的早期妊娠診斷。薄小輝等[21]采集49頭人工授精后28～32d奶牛血液樣品，分離血清并應(yīng)用PAG檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明人工授精后28～32d，PAG檢測(cè)試劑盒檢測(cè)奶牛早期妊娠的靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、準(zhǔn)確性分別為92.0%、95.8%、95.8%、92.0%、93.9%，與B超檢測(cè)方法的結(jié)果一致。

2.3 血小板計(jì)數(shù)

血小板計(jì)數(shù)法可進(jìn)行早期妊娠診斷，其技術(shù)原理是血小板數(shù)量受著床前胚胎釋放的一種中性類脂影響[22]。有研究報(bào)道血小板顯著減少是懷孕早期特有的一種妊娠反應(yīng)，根據(jù)血小板數(shù)量是否顯著減少就可在配種后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)對(duì)母畜做出受精檢查及超早期妊娠診斷[23]。妊娠早期的血小板數(shù)減少，是母體對(duì)妊娠做出的最初的全身性反應(yīng)，而且是各種動(dòng)物僅有的早孕性生理變化，故利用血小板計(jì)數(shù)法可以進(jìn)行超早期妊娠診斷。李助南等[24]用此方法對(duì)30頭受配母牛進(jìn)行了超早期妊娠診斷，經(jīng)與直腸檢查結(jié)果相比較，妊娠母牛符合率為86.36%。經(jīng)探討，該法與直腸檢查結(jié)果有差異的原因可能是胚胎早期死亡。

3 問(wèn)題與展望

目前，雖然已經(jīng)建立了多種奶牛早期妊娠診斷的方法，但是都或多或少存在一些缺點(diǎn)，不能滿足現(xiàn)代奶牛養(yǎng)殖要求。直腸檢查法雖然應(yīng)用最廣泛，但其存在早期妊娠診斷結(jié)果準(zhǔn)確性不高并且易造成胚胎損失等缺點(diǎn)；超聲波檢測(cè)相對(duì)于直腸檢查能夠有效降低胚胎損失，但是操作時(shí)需要具有豐富經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員和昂貴的器材；已有的實(shí)驗(yàn)室方法雖然能滿足準(zhǔn)確、靈敏地進(jìn)行早期妊娠診斷要求，但都存在耗時(shí)長(zhǎng)、不能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問(wèn)題[25]。盡管妊娠診斷技術(shù)近幾年在畜牧業(yè)中得到了迅速的發(fā)展，方法也是多種多樣，但是目前還沒(méi)有一種理想的早期妊娠診斷技術(shù)在實(shí)踐中得以應(yīng)用。理想的早期妊娠診斷技術(shù)應(yīng)具備以下條件：首先在配種后的一個(gè)發(fā)情期內(nèi)應(yīng)顯示出診斷結(jié)果，其次對(duì)于妊娠和未妊娠動(dòng)物的診斷準(zhǔn)確率在90%以上，還需對(duì)母體和胎兒安全無(wú)害，最后要做到操作簡(jiǎn)便、低成本高效益。不論哪一種妊娠診斷方法，只有符合上述條件才能在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛推廣應(yīng)用。為此，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者都在為這樣的一個(gè)目標(biāo)投身到科學(xué)研究當(dāng)中，期望尋找到一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的早期妊娠診斷方法。