檢驗(yàn)豬場免疫效果的方法

朱連德

（北京中科基因技術(shù)有限公司，北京 海淀 100081）

效果評估疫苗免疫已成為豬場疫病防控的主要手段，盡管非洲豬瘟令養(yǎng)豬從業(yè)者和獸醫(yī)的生物安全意識有了很大改變，但豬場對疫苗的期盼和依賴度依然很高，疫苗免疫成為豬場生物安全的最后一道防線。不管是已用疫苗的維持還是新疫苗的應(yīng)用都需要免疫效果檢驗(yàn)結(jié)果的支持。豬群接種后必須及時了解免疫是否合格，免疫的時機(jī)是否準(zhǔn)確，免疫的次數(shù)和間隔是否合適，產(chǎn)生的免疫應(yīng)答抗體是否足以抵抗外來病原微生物的侵害。如果這些問題都不清楚，養(yǎng)豬生產(chǎn)就會存在隱患。若豬群免疫無效或不合格，養(yǎng)豬從業(yè)者或獸醫(yī)需知道應(yīng)根據(jù)哪些指標(biāo)或參數(shù)對疫苗選擇和免疫程序修正做出決策。這需要從臨床、生產(chǎn)到實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的有效監(jiān)控，正確檢驗(yàn)、評估疫苗免疫效果。免疫效果需要利用多種方法綜合檢驗(yàn)評估而不是單一的方法，掌握這些方法不難，重要的是如何利用這些方法真實(shí)地反映出疫苗的有效性和免疫效率。

1 臨床觀察和生產(chǎn)成績比較

這是最為經(jīng)典和樸素的疫苗效果檢驗(yàn)方法。豬場疫苗免疫后1月、3月、6月乃至1年，對應(yīng)疫苗的疾病臨床發(fā)生率大大下降或不再發(fā)生，生產(chǎn)成績比應(yīng)用疫苗之前明顯提高，那能不能說疫苗免疫是有效的呢？通常人們會說是有效的，但考慮到豬場疫病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律及生產(chǎn)中采取的其他措施或環(huán)境、氣候的改變，很難就疫苗免疫效果下結(jié)論。這是在肉眼觀察和生產(chǎn)記錄的基礎(chǔ)上，做出的粗略估計(jì)。

2 臨床對比試驗(yàn)

將生活在相同環(huán)境中的一批豬分成2組，一組用疫苗，另一組不用疫苗，以此對比方法檢驗(yàn)疫苗是否有效。有的豬場可能連續(xù)對比2批或更多批的豬來評估疫苗效果。在生產(chǎn)過程中，尤其是新疫苗上市時，人們通常采用這樣的方法評價(jià)疫苗效果并決定是否選擇應(yīng)用這個疫苗。很多疫苗企業(yè)在新產(chǎn)品上市后，會動員豬場做平行對比試驗(yàn)，免疫豬群與同等年齡和同樣環(huán)境下的未免疫豬群比較，以此來證明疫苗的有效性。如果免疫豬群相對于未免疫豬群臨床癥狀輕微或沒有，生產(chǎn)成績較好，通常認(rèn)為免疫是有效的?？墒羌幢忝庖咝Ч行?，那免疫效率如何，有多少豬產(chǎn)生了有效抗體，免疫保護(hù)率是多少，有效抗體能持續(xù)多久，對比試驗(yàn)依然不能明確回答這些問題。

3 哨兵豬試驗(yàn)

某些豬群，如后備豬群在免疫后，免疫應(yīng)答反應(yīng)是否抑制了其排毒，可以通過哨兵豬投入豬群后予以驗(yàn)證。哨兵豬是易感者，在免疫豬群中1周乃至數(shù)周沒有相應(yīng)疾病的臨床癥狀，則說明疫苗免疫減少或消除了豬群病毒血癥，豬群不再排毒或不具備感染能力?？紤]到哨兵豬健康狀況、環(huán)境等因素影響，這種試驗(yàn)也只能是養(yǎng)豬生產(chǎn)上的一種粗略評估，通常用于免疫凈化方案實(shí)施的豬場。豬藍(lán)耳病弱毒疫苗免疫的陽性豬場，盡量不要用哨兵豬試驗(yàn)方法。除了臨床觀察、生產(chǎn)成績對比等之外，還有一種在實(shí)驗(yàn)室中檢驗(yàn)疫苗免疫效果的方法，那就是攻毒試驗(yàn)。但在豬場內(nèi)是斷不可以這樣做的，這會給養(yǎng)豬生產(chǎn)帶來非常大的風(fēng)險(xiǎn)。

4 抗體檢測

一般完成免疫接種程序后，可以通過檢測血液中的抗體水平判斷疫苗接種的效果，目前常用的有以下幾種。

4.1 正向間接血凝試驗(yàn)(IHA)

其原理是將抗原(或抗體)包被于紅細(xì)胞表面，成為致敏的載體，然后與相應(yīng)的抗體(或抗原)結(jié)合，從而使紅細(xì)胞拉聚在一起，出現(xiàn)可見的凝集反應(yīng)。目前已有商用試劑盒，可以按說明書操作。豬瘟、豬口蹄疫抗體的檢驗(yàn)均可采用此法。豬瘟弱毒疫苗免疫后血清血凝效價(jià)（或者說抗體水平）≥1∶16為免疫合格；豬口蹄疫滅活疫苗免疫后血清血凝效價(jià)≥1∶128為免疫合格。該方法也可以用于豬細(xì)小病毒抗體和豬流感病毒抗體的測定和檢驗(yàn)。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

4.2.1 間接ELISA

其原理是將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結(jié)合成固相抗原受檢抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗（針對受檢抗體的抗體）與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，用分光光度計(jì)定量測定加底物后的顯色程度，確定待測抗體含量。目前已經(jīng)用于豬藍(lán)耳病病毒抗體、豬瘟病毒抗體、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌抗體的檢測。百測（Biochek）對豬偽狂犬病gB和豬圓環(huán)病毒抗體的檢測用的也是這種方法。

4.2.2 阻斷ELISA

該方法是用抗原包被固相載體，加入待檢樣品，然后加入酶標(biāo)單克隆抗體，最后加底物顯色。呈色反應(yīng)的深淺與樣品中的抗原呈反比，主要用于測定抗體。豬瘟、豬偽狂犬病gE、豬口蹄疫、豬流感病毒抗體、豬傳染性胃腸炎抗體檢測均可用此法。

4.2.3 雙抗原夾心ELISA

原理是將抗原固定在固相載體表面，抗體一個臂與該固定抗原結(jié)合，另一個臂與酶標(biāo)或者金標(biāo)的抗原結(jié)合，形成抗原-待檢抗體-標(biāo)記抗原的“夾心”，經(jīng)顯色劑顯色，測出抗體水平?？捎糜谪i流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒抗體等的檢測。

4.3 血清中和試驗(yàn)（SNT）

這是一種用已知病毒測定血清中特異性抗體的方法。豬瘟、豬偽狂犬病、傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉等病毒抗體檢測應(yīng)用此法。目前商用ELISA試劑盒愈來愈多，操作方便，比較廣泛地應(yīng)用于疫苗免疫后抗體水平檢測。

5 病原檢測

疫苗免疫后，豬群是否存在病毒血癥或菌血癥，唾液、鼻分泌物、尿液、糞便等分泌和排泄物是否有病原，排毒持續(xù)多久，這也是評估疫苗免疫效果的方法之一。

5.1 PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）方法

這是一種用于放大、擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，該技術(shù)將微量的DNA大幅增加。包含普通PCR、RT-PCR、RealTime PCR等。DNA病毒使用PCR，RNA病毒提取核酸后需要反轉(zhuǎn)錄，即RNA病毒使用RT-PCR。二者均可使用熒光PCR進(jìn)行檢測，大大提高檢測的靈敏度?，F(xiàn)在研發(fā)出一些常溫下操作的快檢設(shè)備。豬藍(lán)耳病、豬瘟、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒、非洲豬瘟等病毒均可使用PCR方法檢測。目前非洲豬瘟的檢測診斷主要是熒光定量PCR的方法，尚沒有非洲豬瘟疫苗，便也談不上檢驗(yàn)評估了。

5.2 生物芯片

其是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子，比如核酸片段、多肽分子甚至細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，然后與已標(biāo)記的待測生物樣品中靶分子雜交，通過特定的儀器對雜交信號的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。現(xiàn)在有生物芯片檢測豬瘟、豬口蹄疫、豬偽狂犬病、非洲豬瘟、豬流行性腹瀉病毒等，市場上也出現(xiàn)了高通量、現(xiàn)場檢測的數(shù)字化生物芯片。

5.3 膠體金檢測

常用的是“膠體金免疫層析法”，在檢測帶上可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用方便。膠體金技術(shù)適于豬瘟、豬口蹄疫、豬偽狂犬病、豬流行性腹瀉病毒等血、尿液或糞便的檢測，現(xiàn)在豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒的膠體金檢測試劑盒以及多聯(lián)檢的膠體金試劑盒也已開始使用。

5.4 ELISA雙抗體夾心法

連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中待檢抗原分子上2個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-待檢抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物，加入該酶的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量?？捎糜谪i流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒等檢測。此外，還有對豬體免疫系統(tǒng)檢測的方法，譬如對細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測，干擾素、免疫細(xì)胞、免疫因子的變化，可以反映疫苗免疫應(yīng)答情況，但目前主要在實(shí)驗(yàn)室研究用，尚未用于豬場生產(chǎn)的臨床實(shí)踐。

6 總結(jié)

上述檢測方法中如今有不少商品化試劑盒和快檢設(shè)備可用，并且隨著第三方獨(dú)立檢測機(jī)構(gòu)的出現(xiàn)，疫苗免疫效果的檢驗(yàn)、評估也越來越專業(yè)、高效。作為豬場獸醫(yī)或?qū)＜翼毧茖W(xué)、合理地制定試驗(yàn)方案、采樣計(jì)劃，正確地采樣和處理樣品，應(yīng)用規(guī)范、正確的結(jié)果分析方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。豬場疫苗免疫效果受疫苗質(zhì)量、豬體免疫反應(yīng)、其他疫苗與疾病的干擾、免疫時機(jī)和免疫操作等因素影響，在實(shí)際生產(chǎn)中，通過臨床和生產(chǎn)成績來確切地評估疫苗的免疫效果是不容易的，應(yīng)該在豬群免疫后分2個、3個甚至更多時間段采樣檢測。采樣設(shè)計(jì)是很關(guān)鍵的，譬如在檢測群豬的抗體時，應(yīng)在免疫時間軸上，選擇2個或更多時間點(diǎn)采樣檢測抗體以了解抗體產(chǎn)生、消長變化。檢測抗原，要注意避開弱毒疫苗病毒血癥時間采樣檢測病原。

有些疫苗如豬圓環(huán)病毒疫苗免疫后，檢測是否存在病毒血癥，僅這一個參數(shù)是無法評定疫苗保護(hù)效果的。所以豬場應(yīng)根據(jù)不同種類、不同性質(zhì)的疫苗，確定不同的檢驗(yàn)評估、實(shí)驗(yàn)室檢測方法和相應(yīng)的檢驗(yàn)、評估參數(shù)，如發(fā)病率、死亡率、日增重、抗體/抗原陽性率、抗體合格率、合格抗體持續(xù)時間、變異系數(shù)CV值、排毒時長、循環(huán)Ct值等中的多個或全部參數(shù)。檢驗(yàn)檢測的方法很重要，豬場在選擇試劑盒后，一定要清楚試劑盒適合的條件，不同試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等。此外，實(shí)驗(yàn)室檢測是一個體系，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件、檢測的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）、檢測方法、檢測人員能力、檢測用耗材試劑、儀器設(shè)備等都要合格、配套，僅注重精密和貴重儀器設(shè)備是不行的。疫苗免疫效果包含疫苗的有效性和免疫效率2個方面，因此豬場疫苗效果檢驗(yàn)、評估，不能僅憑直覺、憑經(jīng)驗(yàn)、憑肉眼觀察和憑疫苗的口碑，應(yīng)有真實(shí)的臨床數(shù)據(jù)，正確的實(shí)驗(yàn)室檢測數(shù)據(jù)，科學(xué)的分析評估標(biāo)準(zhǔn)，做到真正量化評估指標(biāo)，使得豬群免疫管理和健康管理數(shù)字化和更加科學(xué)化。