聯(lián)合檢測EGR-1與HER-2在卵巢癌中的表達及意義＊

柯燦燦，繆振忠，王芬

(1.南昌大學，南昌 330006；2.南昌大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，南昌 330006)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤[1]。2015年我國約有52100例女性被確診為卵巢癌，約22500例女性死于卵巢癌[2]。近些年來，我們在卵巢癌的治療方面取得諸多進展，但晚期卵巢癌患者5年生存率并沒有得到有效提高，一直徘徊在30%[3]左右，其最主要的原因在于缺乏早期有效的篩查手段，導致大多數(shù)患者確診時已為晚期。因此，如何提高卵巢癌的早期診斷成為了改善卵巢癌患者預(yù)后最有效的途徑[4]。腫瘤標志物在腫瘤的診斷、腫瘤病人病情監(jiān)測以及判斷腫瘤預(yù)后的方向有著十分重要的作用，近年來，腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)依然是腫瘤學者的研究熱點[5]。

HER-2為人表皮生長因子受體家族成員之一，它是其它家族成員的共受體，可形成同源或異源二聚體，從而啟動一系列信號轉(zhuǎn)導通路，激活酪氨酸激酶活性啟動一系列信號轉(zhuǎn)導通路介導細胞的增殖、分化、抗凋亡等過程從而參與多種腫瘤的發(fā)生，這一論點已被國內(nèi)外廣泛公認[6]。目前已知Her-2基因擴增和蛋白過表達能幫助判斷HER-2陽性乳腺癌、胃癌患者的預(yù)后情況[7]。有研究表明，Her-2可作為卵巢癌的1個獨立預(yù)后因素，Her-2的高表達與卵巢癌的預(yù)后呈負相關(guān)[8]。但也有研究表明Her-2的過表達與卵巢癌的預(yù)后無相關(guān)性[9]。本研究可進一步證實Her-2與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系。

早期生長反應(yīng)因子1（EGR-1）是一種早期生長反應(yīng)基因，屬于轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白家族成員。它可以在幾分鐘內(nèi)激活一系列信號通路，其活性在數(shù)小時內(nèi)即衰退。滲透壓改變、熱休克、缺氧、DNA損傷、輻射損傷等應(yīng)激都會刺激EGR-1的表達。EGR-1通過多種通路調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡。但是，目前關(guān)于EGR-1在卵巢癌中的發(fā)生、發(fā)展中起到什么樣的作用還未有明確的報道。本研究運用免疫組化的方式檢測EGR-1蛋白在卵巢癌的表達情況，探討EGR-1在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的過程中的作用與意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年1月到2013年6月80例在南昌大學第一附屬醫(yī)院進行卵巢癌手術(shù)的病例，病例臨床、病理資料均完整，術(shù)前未進行過化療、放療和細胞因子等治療，未合并有其他腫瘤或嚴重合并癥（高血壓、糖尿病，其他急慢性疾病等）作為研究組C組。80例OC病人（漿液性癌51例、粘液性癌21例、其他類型的8例）的臨床病理資料：患者年齡35～78歲，中位年齡56歲，根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期：Ⅰ-Ⅱ期23例，Ⅲ-Ⅳ期57例；按照組織學分級為高分化9例，中分化29例，低分化42；有淋巴轉(zhuǎn)移57例，無淋巴轉(zhuǎn)移23例。根據(jù)取材的標準，對照組選40例因婦科良性疾病需切除或活檢所取得的卵巢良性腫瘤組織為B組，同樣選取20例正常的卵巢組織為A組，所有患者都經(jīng)排除未患有其他惡性腫瘤或合并其他系統(tǒng)急慢性疾病。

1.2 實驗主要試劑與試驗方法 主要試劑：兔抗人EGR-1多克隆抗體和兔抗人HER-2多克隆抗體購自美國ABclonal公司進口，濃縮DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

實驗方法：將已經(jīng)收集好的石蠟包埋的組織標本，逐個放置于切片機上，將蠟塊與刀刃的位置和角度調(diào)好之后，制成5μm，邊緣整齊平整的組織切片2張，而且卵巢癌患者蠟塊要求每個組織切片中均含有瘤巢。免疫組化的操作步驟按照說明書進行烤片脫水、脫蠟、水化-高溫高壓抗原熱修復(fù)-滴加一抗-4°C冰箱中保存過夜-放入PBS緩沖液中清洗后滴加二抗-DBA染色-蘇木精復(fù)染、分化返藍——脫水、封片。其中一抗中抗EGR-1抗體稀釋濃度為1：100；抗HER-2抗體稀釋濃度為 1：150。

1.3 HER-2、EGR-1的免疫組織化學染色結(jié)果判定 HER-2的陽性結(jié)果主要定位于細胞膜或者細胞漿內(nèi)，其陽性反應(yīng)表現(xiàn)棕黃色。根據(jù)細胞核或者細胞漿染色的深淺以及染色的范圍來進行判定，結(jié)果判定如下：⑴按照陽性細胞百分數(shù)：陰性則0分，陽性細胞≤5%計1分，6%-50%記2分，50%-75%計3分，＞75%則4分。⑵按照切片染色強弱來評分：棕褐色表現(xiàn)3分，棕黃色表現(xiàn)2分，淡黃色表現(xiàn)計1分，無色記錄0分。免疫組化陽性分4個等級 （計算方法：⑴⑵）：0-2分表現(xiàn)為-（陰），3-4分為+，5-8分為++，9-12分為+++。

EGR-1的陽性結(jié)果主要存在于細胞核，棕色顆粒顯色位于細胞核才是陽性。根據(jù)細胞核染色的深淺以及染色的范圍等情況來進行綜合的判定。⑴按照陽性細胞百分數(shù)：陽性細胞≤25%計1分，25%-50%記2分，50%-75%計3分，＞75%則 4分。⑵按照染色染色強度評分標準：細胞不著色記1分；細胞著色稍稍高于背景色記2分；細胞著色強度高于背景色記3分；細胞核著色呈深褐色，明顯高于背景色記4分。最終的染色指數(shù)為該標本染色陽性細胞百分與染色強度兩者的乘積，以染色指數(shù)來判定免疫組化的結(jié)果：評分為1-2分屬于低表達，評分3-16分是高表達。

1.4 隨訪 研究組患者臨床、病理及基本資料齊全建檔。所有患者出院后進行隨訪，手術(shù)后第1年，對患者每3個月隨訪1次；術(shù)后第2年每4-6個月1次。截止日期2018年3月，隨訪期如果患者出現(xiàn)死亡或消失聯(lián)系不上者則終止隨訪。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計，計數(shù)數(shù)據(jù)運用χ2檢驗，5年生存率采用Kaplan-Meier進行分析該二者表達對OC患者預(yù)后影響。

2 結(jié)果

2.1 HER-2蛋白在3組中的表達 在80例OC患者、40例良性卵巢腫瘤組織、20例正常卵巢組織的石蠟組織切片中，HER-2蛋白表達陽性率分別為 42.5%（34/80）、0.25%(1/40)、0.00%（0/20）， 卵巢癌患者與良性卵巢組織以及正常卵巢組織表達有明顯的差異，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（如表 1），而良性卵巢組織和正常卵巢組織表達差異（P＞0.05）。

2.2 EGR-1蛋白在3組中的表達 在80例卵巢癌患者、40例良性卵巢腫瘤組織、20例正常卵巢組織的石蠟組織切片中，EGR-1均產(chǎn)生表達，但是EGR-1在其中的低表達率分別為 60%（48/80）、10%(4/40)、15%（3/20）， 差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。 見表 2。

表1 HER-2蛋白在EOC及正常卵巢組織中的表達

表2 EGR-1在EOC及正常卵巢組織中的表達

2.3 HER-2在OC中的表達與臨床病理指標間的關(guān)系 在OC中，HER-2蛋白陽性率表達組間比較，根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，HER-2的陽性率的表達均與卵巢癌的FIGO分期、淋巴節(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān) （P＜0.05），但是與年齡、病理類型、病理分級無關(guān)（P＞0.05）。見表 3。

2.4 EGR-1在OC中的表達與臨床病理指標間的關(guān)系 在OC中，EGR-1蛋白的高低表達組間比較，根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，EGR-1的低表達率與卵巢癌的FIGO分期、組織分化程度、淋巴節(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān) （P＜0.05），但與年齡、病理類型無關(guān)（P＞0.05）。 見表 4。

2.5 HER-2與EGR-1與OC患者預(yù)后的關(guān)系 對80例卵巢癌患者隨訪時間60月，中位隨訪時間為52月，受訪的OC患者5年總生存率是46.1%，中位生存時間是52.8個月。根據(jù)Kaplan-Meier生存曲線分析，HER-2陽性表達患者其5年生存率低于陰性表達患者，（20.7%VS 47.8%，P=0.004）。EGR-1低表達患者其5年生存率為20.1%，高表達者為52.6%，組間比較差異有意義（P=0.005）。而HER-2(+)EGR-1低表達組的5年生存率（18.18%）與HER-2(-)EGR-1高表達組的表達組5年生存率（80%）相比，組間差異有統(tǒng)計學意義（P≤0.05），說明HER-2表達以及EGR-1表達的高低可能與預(yù)后相關(guān)。

3 討論

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居于婦科惡性腫瘤首位，嚴重威脅女性健康[10]。卵巢癌起病隱匿，臨床上缺乏早期篩查手段，發(fā)病人群缺乏特異性，導致70%的患者確診時已屬卵巢癌晚期，而晚期患者5年生存率往往不足30%，但是早期卵巢癌患者5年生存率能夠達到90%[1]。因此，尋找卵巢癌的早期腫瘤標記物是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

3.1 HER-2與卵巢癌 HER-2癌基因是一種促癌基因，一般情況下HER-2只會在胎兒時期有表達，但是成年以后，在極少組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)其在低的水平表達于細胞表面，正常組織僅可測到少量的HER-2/neu基因，正常情況下，不會導致腫瘤的發(fā)生。而有些因為內(nèi)或者外界因素原因的刺激下，HER-2/neu基因可能還會轉(zhuǎn)化為活性癌基因，從而導致正常細胞的迅速分裂，過度增殖，良性腫瘤中無HER-2過表達，HER-2基因在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要的作用甚至向惡性轉(zhuǎn)化如肺腺癌，乳腺癌，卵巢癌等癌癥中存在過度表達[11，12]。

表3 HER-2在OC中的表達與臨床各指標之間的關(guān)系

表4 EGR-1在OC中的表達與臨床各指標之間的關(guān)系

HER-2與臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系研究結(jié)論有很多的不一致。劉云春[13]、李明玉[14]等研究中都表示HER-2蛋白過表達與卵巢癌的FIGO分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與組織學的分級、病理學類型沒有相關(guān)性。但是也有另外一些學者主張[15]的研究結(jié)果不支持以上結(jié)論，他們認為HER-2與臨床病理特征沒有相關(guān)性。

本研究表明，HER-2的表達隨著FIGO分期增高其陽性表達率逐漸增高，HER-2蛋白的表達與卵巢癌患者是否出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達增高，提示其惡性程度高以及患者不良預(yù)后。但是其陽性表達與年齡、組織病理分化程度、臨床病理類型無關(guān)。

3.2 EGR-1與卵巢癌 EGR-1屬于即刻早期基因家族成員之一，是一種含有特殊的3個鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，該基因定位于5q31，長2.1kb，編碼3.3kb成熟的mRNA。EGR-1基因編碼的EGR-1蛋白包含DNA結(jié)合域、抑制結(jié)構(gòu)域和活化結(jié)構(gòu)域這三個部分。EGR-1的DNA結(jié)合域是在鋅離子的存在下，鋅指結(jié)構(gòu)與DNA序列中的富含GC區(qū) （CGCCCCGC）結(jié)合，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。NGFI-A結(jié)合蛋白1或2可以通過與EGR-1的抑制結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而引起EGR-1生物活性的抑制[16]。

EGR-1能夠在血清、胰島素、內(nèi)皮素、維甲酸等多種調(diào)控因子的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)錄。在參與調(diào)控細胞的生長、損傷、修復(fù)相關(guān)多種基因的表達的過程中同時也受多種因素調(diào)控，如電離輻射、缺氧神等[17]。EGR-1基因表達的功能主要在接受外界信號刺激后，基因表達的產(chǎn)物在細胞內(nèi)的信號傳遞，通過信號通路的級聯(lián)反應(yīng)從而調(diào)控下游靶基因的表達，實現(xiàn)相關(guān)的生物學功能[18]。

細胞的正常生長以及分化均與EGR-1基因的激活緊密相關(guān)，而正常細胞的失分化是腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，EGR-1蛋白結(jié)合位點位于含有多種生長因子基因和原癌基因的啟動子區(qū)域中，因此，EGR-1基因的激活與腫瘤的發(fā)生可能有關(guān)。Ronski等[19]研究表明，EGR-1在絕大多數(shù)的腫瘤中都呈現(xiàn)低水平的表達，例如肺癌、纖維肉瘤及平滑肉瘤、甲狀腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、乳腺癌等，在人惡性骨髓瘤和ER陰性乳腺癌中EGR-1基因甚至是無表達的，對于這些腫瘤來說，EGR-1可能起到抑制腫瘤細胞生長的作用。在乳腺癌細胞中EGR-1是呈低表達狀態(tài)的，但是在服用他莫昔芬治療后EGR-1與正常乳腺組織的表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學的差異[20]。Levin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌組織中EGR-1表達量明顯是低于癌旁組織，這個結(jié)果提示EGR-1表達的下調(diào)與肺癌發(fā)生是有密切關(guān)系的。既往的實驗研究也已經(jīng)證實了EGR-1可以抑制多種腫瘤細胞的生長，如肝癌、乳腺癌、纖維肉瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、食管癌等[19]。從以上的研究推斷。所以我們可以推斷，EGR-1可能是這些腫瘤的抑制基因。

本研究我們發(fā)現(xiàn)EGR-1在卵巢癌組織中的表達與FIGO分期，分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，F(xiàn)IGO分期越高，分化程度越低，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，EGR-1表達越低；而與年齡和病理分型無關(guān)。這說明EGR-1在卵巢癌中扮演著抑制基因的角色。

EGR-1基因與腫瘤的關(guān)系頗為復(fù)雜，它與癌基因和抑癌基因的關(guān)系、對靶基因調(diào)節(jié)的分子機制等尚未完全清楚，對放射誘導后相關(guān)基因表達變化以及對放射敏感性的影響國內(nèi)外研究較少，對這些問題的不斷深入研究和解決將對真正實現(xiàn)腫瘤個體化放療將產(chǎn)生重大影響，使廣大患者通過基因檢測就可預(yù)測放療療效成為可能。

本研究運用免疫組化的方法檢測HER-2，EGR-1在卵巢癌的表達情況，后期實驗可以聯(lián)合檢測HER-2，EGR-1在血清中與組織中的表達，觀察其是否可以成為新的卵巢癌的腫瘤標記物，為卵巢癌的早期診斷提供新的方法。